鸽源益生性芽孢杆菌的分离鉴定及安全性评价
摘 要：本研究旨在分离筛选出１株性能优良且安全的鸽源益生性芽孢杆菌，为鸽源益生菌添加剂的研发提供菌种资源。取健康白羽王鸽新鲜粪便和肠道内容物，先通过细菌分离培养、染色镜检、生化鉴定和分子生物学鉴定的方法对菌株进行分离鉴定，然后对菌株进行耐酸能力、耐胆盐能力、生长曲线、溶血活性、药物敏感性及抑菌活性等体外益生性能检测，初步判断分离菌株的体外益生潜能，最后通过小鼠急性和亚急性毒性试验评估其体内安全性。结果显示：1）从白羽王鸽新鲜粪便和肠道内容物共分离得到３株芽孢杆菌（F21、F31、F54），经生化鉴定与16S rRNA测序分析，均为枯草芽孢杆菌。2）３株分离菌在pH为2.0条件下的存活率均在60%以上，在胆盐浓度为0.3%条件下的存活率均在70%以上；３株分离菌均能在２～４ｈ进入对数生长期，12～16ｈ后进入稳定期；３株分离菌均不具有溶血活性；３株分离菌的药物敏感性表现为F31＞F21＞F54；F21、F31对３种常见致病菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌）有抑制效果。３）选取体外益生性能较好的枯草芽孢杆菌F31，对其进行体内安全性评价。7ｄ的急性毒性试验显示，小鼠体征正常，剖检脏器无眼观病理变化；28ｄ的亚急性毒性试验显示，与对照组相比，中剂量组（1.1×109CFU/mL，0.2mL/只）小鼠体重显著增加（P＜0.05），低剂量组（1.1×108CFU/mL，0.2mL/只）小鼠肝脏指数显著降低（Ｐ＜0.05），高剂量组（1.1×1010CFU/mL，0.2mL/只）小鼠的脾脏指数显著升高（Ｐ＜0.05），低剂量组小鼠血液白细胞数、淋巴细胞数、单核细胞数及中性粒细胞数显著降低（Ｐ＜0.05）。综上所述，枯草芽孢杆菌F31具有良好的体外益生潜能，体内安全性评价良好，可作为鸽源益生菌制剂候选菌株用于后续的开发与应用。
关键词：鸽；芽孢杆菌；分离鉴定；益生性能；安全性
鸽子已成为我国第四大家禽，在鸽子养殖过程中，滥用抗生素会导致细菌耐药性的产生及抗生素残留等问题，甚至危害公共卫生安全，因此，对抗生素替代品的研究显得尤为重要。常见的抗生素替代品有酶制剂、酸化剂和益生菌制剂等，其中，益生菌制剂因具有促进宿主代谢、抵抗病原菌感染、增强宿主免疫力等功能而被广泛关注。益生菌制剂作为当前畜禽业养殖中替代饲用抗生素的制剂之一，在饲用效果、安全性等方面均有显著优势。芽孢杆菌是益生菌制剂中的常用菌种，可以用于预防或治疗细菌性疾病以及提高畜禽生长性能。研究发现，在饲粮中添加枯草芽孢杆菌能够有效抑制肉鸽肠道中有害菌群的生长，具有较强的抗菌作用；还能够提高肠道内容物和肠上皮细胞刷状缘酶活性，增强肠道对营养物质消化利用的能力；并能提高乳鸽的免疫力和抗病力。同源益生菌由于天然存在于宿主防御系统中，更容易在原生环境中发挥益生作用，且对致病菌的拮抗能力更强。目前关于鸽源益生性芽孢杆菌的相关研究较少，因此分离筛选出益生性能优良的鸽源益生性菌种愈发重要。本试验采集了新疆喀什某规模化鸽厂健康白羽王鸽的新鲜粪便及肠道内容物，对其进行益生性芽孢杆菌的分离鉴定，通过体外益生潜能筛选优秀菌株并对其进行小鼠体内安全性试验，旨在筛选出益生性能优良且安全的鸽源益生性芽孢杆菌，为鸽源益生菌添加剂的研发提供菌种资源。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 样品采集和试验动物
无菌采集18只健康白羽王鸽的新鲜粪便样品36份及肠道内容物18份，共54份样品。采集后，将上述样品放入无菌的4 mL LB肉汤培养基中，４℃保存并运回实验室。试验动物为84只昆明小鼠，公母各占1/2，体重（24±2）ｇ，购自新疆医科大学实验动物中心，动物合格证号为：SXXK2018-000。动物试验方案经新疆农业大学伦理委员会批准，批准号为2017013。
1.1.2 主要试剂及供试菌株
LB琼脂培养基、LB肉汤培养基、HBI芽孢杆菌生化鉴定条、绵羊血平板购自青岛海博生物技术有限公司；牛胆盐、革兰氏染色液购自北京索莱宝科技有限公司；细菌药敏试纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；4%多聚甲醛、中性树胶为Biosharp品牌产品；石蜡购自上海懿洋仪器有限公司；金黄色葡萄球菌、牛源大肠杆菌K99、鼠伤寒沙门氏菌菌株由新疆农业大学临床产科实验室提供。
1.2 试验方法
1.2.1 芽孢杆菌的初筛
1.2.1.1 芽孢杆菌的培养及形态学观察
参照孟维珊等的方法，用灭菌生理盐水将样品稀释，80℃水浴15min后均匀涂布于LB琼脂培养基上，37℃培养36ｈ，挑取菌落形态一致的单菌落于LB平板上进行纯化，纯化３次后于LB肉汤培养基中增殖培养，对分离菌株进行革兰氏染色后镜检及观察。
1.2.1.2 生化鉴定
取分离菌株接种至HBI芽孢杆菌生化鉴定条，根据说明书进行操作，观察并记录结果。
1.2.1.3 分子生物学鉴定
将纯化好的菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行16SrRNA测序，测序结果在NCBI上进行BLAST比对。
1.2.2 分离菌株的体外益生性能筛选
1.2.2.1 耐酸能力试验
将磷酸盐缓冲液（PBS）的pH分别调整至7.0、5.0、3.0、2.0，高压灭菌。取１mL浓度为1×108CUF/mL的分离菌株菌悬液，离心后弃上清加入上述PBS，振荡培养2ｈ后，取50μL菌悬液接种于５mLLB肉汤培养基中，37℃培养12ｈ后测定其在600nm处的吸光度（OD600nm）值。每种分离菌株进行３次重复试验。按照如下公式计算分离菌株的存活率：存活率（%）＝100×Nx/N0。
式中：Nx为pH为2.0、3.0或5.0时的OD600nm值；N0为pH为7.0时的OD600nm值。
1.2.2.2 耐胆盐能力试验
将PBS的胆盐浓度分别调整至0、0.1%、0.2%、0.3%，高压灭菌。取１mL浓度为1,1×108CUF/mL的分离菌株菌悬液，离心后弃上清加入上述PBS，振荡培养２ｈ后，取50μL菌悬液接种于５mL LB肉汤培养基中，37℃培养12ｈ后测定OD600nm值。每种分离菌株进行３次重复试验。按照如下公式计算分离菌株的存活率：
存活率（%）＝100×Ny/N0.
式中：Ny为胆盐浓度为0.1%、0.2%或0.3%时的OD600nm值；N0为胆盐浓度为０时的OD600nm值。
1.2.2.3 生长曲线测定
取分离菌株菌悬液，以２%的接种量接种于LB肉汤培养基中，37℃培养28ｈ，从0ｈ开始每隔２ｈ测１次OD600nm值，每种分离菌株重复测定３次，收集并统计所有测量数据，绘制分离菌株的生长曲线。
1.2.2.4 溶血活性测定
取分离菌株菌悬液100μL，用灭菌生理盐水稀释后均匀涂布于绵羊血平板上，于37℃恒温培养箱培养24ｈ，观察菌落周围有无溶血环。
1.2.2.5 药物敏感性试验
参照Hou等的方法，选取头孢噻呋、青霉素Ｇ、庆大霉素、卡那霉素等13种常用抗生素对分离菌株进行药物敏感性试验。先用无菌棉签将稀释至0.5号麦氏标准管浊度的分离菌株菌悬液（1×108CUF/mL）涂布于LB固体培养基上，然后将药敏试纸片放置在培养基上，37℃培养24ｈ，测量抑菌圈直径。结果判定参照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）标准。
1.2.2.6 抑菌活性测定
参照王琦等的方法，用无菌棉签分别蘸取浓度为1×108CUF/mL的金黄色葡萄球菌、牛源大肠杆菌K99、鼠伤寒沙门氏菌菌悬液，均匀涂布于LB固体培养基表面，将无菌的牛津杯放置在培养基上，向牛津杯中加入200μL浓度为1.1×108CUF/mL的新鲜分离菌株菌悬液，37℃培养24ｈ。每种分离菌进行３次重复试验。测量抑菌圈直径，根据抑菌圈直径判定菌株的抑菌活性。
1.2.3 分离菌株体内安全性评价
参照农业农村部制定的《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》和巨敏莹等的报道，对分离菌株进行安全性评估。
1.2.3.1 急性毒性试验
28只昆明小鼠适应环境7ｄ后随机分为2组，每组14只，公母各占1/2。小鼠自由采食和饮水。在第１天，对照组小鼠腹腔注射生理盐水（0.2mL/只），试验组小鼠腹腔注射浓度为1.1×1010CUF/mL的枯草芽孢杆菌F31菌悬液（0.2mL/只），持续观察小鼠的体重变化、毛色、整体精神状态及分泌物、排泄物状况，7ｄ后安乐处死所有小鼠，解剖观察各组织器官是否存在病理变化。
1.2.3.2 亚急性毒性试验
56只昆明小鼠适应环境7ｄ后随机分为４组，每组14只，公母各占1/2。对照组灌胃生理盐水（0.2mL/只），其他３组分别灌胃浓度为1.1×108（低剂量组）、1.1×109（中剂量组）、1.1×1010CUF/mL（高剂量组）的枯草芽孢杆菌F31菌悬液（0.2mL/只），持续灌胃28ｄ。每日灌胃前记录小鼠体重，观察小鼠精神状态、饮食饮水及排泄物情况。灌胃结束后，采集小鼠血液，进行血细胞指标分析；安乐处死所有小鼠，取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和胸腺，无尘纸擦干表面水分后称重，计算脏器指数［脏器指数（%）＝100×脏器重（ｇ）/体重（ｇ）］；采集部分肝脏、脾脏组织，将其置于４%多聚甲醛中固定，制作石蜡切片，然后进行苏木精－伊红（HE）染色，在显微镜下观察组织病理变化情况。
1.3 数据统计与分析
试验数据采用SPSS17.0软件进行统计分析，对小鼠急性毒性试验结果进行ｔ检验，亚急性毒性试验结果进行单因素方差分析（one-wayANO-VA），P＜0.05表示差异显著。结果以平均值±标准差表示。使用GraphadPrism8.0软件绘图。
2 结果与分析
2.1 芽孢杆菌的初筛结果
2.1.1 芽孢杆菌的培养及形态学观察
从LB琼脂培养基上分离得到３株菌，分别命名为F21、F31、F54。F21、F31菌株的菌落特征均为表面干燥，边缘粗糙，不透明，呈乳白色，有隆起；F54菌株的菌落特征为表面略湿润，边缘粗糙，呈乳白色，有隆起（图１－Ａ）。革兰氏染色后，在油镜下观察到这３株菌均为蓝紫色的革兰氏阳性杆菌（图１－Ｂ）。
Ａ：LB琼脂培养形态观察；Ｂ：革兰氏染色（100×）。
2.1.2 生化鉴定
分离菌株的生化鉴定结果见表１，参照《伯杰细菌鉴定手册》，初步判定分离菌株F21、F31、F54均符合枯草芽孢杆菌的生化特性。
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Bacills：芽孢杆菌属；Bacills_tequilensis：特基拉芽孢杆菌；Bacills_subtilis：枯草芽孢杆菌；bacteria：细菌；strain：菌株。
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2.2.2 耐胆盐能力
由表３可知，３株分离菌经胆盐浓度为0.3%的PBS处理后，存活率均在70%以上。其中，F54菌株的耐胆盐能力最强，在胆盐浓度为0.3%条件下存活率仍可达84.81%。
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2.2.4 溶血活性
如图４所示，F21、F31、F54菌株在绵羊血平板上培养后，在菌落周围均未观察到溶血环。
通过体外益生特性试验结果筛选出F31菌株的耐酸耐胆盐能力好、不具有溶血活性、药物敏感性强、抑菌效果明显，对F31菌株进行小鼠急性和亚急性毒性试验，探究其剂量安全性。
2.3.1.2 小鼠剖检观察
小鼠腹腔注射枯草芽孢杆菌F31 7ｄ后，对照组与试验组小鼠均未见异常的身体活动变化、精神状态和毒性的临床体征，２组小鼠剖检腹腔内脏器无明显眼观病理差异。
2.3.1.2 生长性能
由表６可知，试验组小鼠的终末体重、平均日增重、体重增长率与对照组均无显著差异（Ｐ＞0.05）。
同行数据肩标不同字母表示差异显著（Ｐ＜0.05） ，相同字母或无字母表示差异不显著（Ｐ＞0.05） 。 下表同
2.3.2.1 小鼠剖检观察
灌胃枯草芽孢杆菌F31过程中，４组小鼠无中毒及死亡现象且毛色、精神状态、食欲、排便情况均正常，剖检时小鼠口、鼻、耳及肛门处无异常分泌物，各脏器眼观无明显异常。
图５可知，低剂量组、高剂量组小鼠28日龄体重与对照组均无显著差异（Ｐ＞0.05），中剂量组小鼠28日龄体重显著高于对照组（Ｐ＜0.05）。
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