水产病原弧菌拮抗菌的筛选及其抗菌物质分离

 

摘 要：为了探索上清液天然抑菌物质最佳发酵条件以及其稳定性，采用了平板对峙法，筛选对哈维氏弧菌有显著拮抗效果的拮抗菌，通过不同硫酸铵饱和度盐析出抗菌粗蛋白。结果表明：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis BS2-7)对水产病原－哈维氏弧菌(V. harveyi GDH11385)拮抗效果最显著；发酵培养基、发酵温度对抑菌活性无显著影响，发酵时长对抑菌活性具有显著影响(P<0.05)；上清液抗菌谱较广，对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌、副溶血弧菌和高地芽孢杆菌具有拮抗活性；温度、酸碱度和紫外照射对上清液抑菌物质的抑菌活性具有显著性影响(P<0.05)；向上清液中添加饱和度达到10%和20%的硫酸铵药品时，所析出的粗蛋白对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌具有抑菌活性。研究结果可为生物防治弧菌病原抗菌蛋白药物的开发提供样本支撑和理论依据。

关键词：哈维氏弧菌；欧文氏弧菌；贝莱斯芽孢杆菌；抗菌蛋白

引言

近年来，随着水产养殖技术的不断提升，中国水产品生产模式逐步向“以养为主”转变，深远海、工厂化、陆基循环水养殖以及鱼菜共生等新型设施渔业发展迅速，推动水产养殖产量不断增长。但是，密集的养殖模式造成排泄物底部堆积和养殖水体底部氧气贫瘠，为病原微生物生长提供了适宜环境。病原微生物快速生长是爆发水产病害的直接因素。

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是一种生长在河口区域的革兰氏阴性细菌，是水产养殖业最主要的病原菌，在其生长过程中分泌的物质可致水生生物患病死亡，哈维氏弧菌感染的水产种类有凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、石斑鱼(Epinephelus coioides)大黄鱼(Larimichthy scrocea)、尖吻鲈(Lates calcarifer)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、紫扇贝(Argopecten purpuratus)。患病水生动物会出现眼部病变/失明、皮肤溃疡、胃肠炎、肌肉坏死和尾腐病等一系列症状。

在水产养殖领域中治疗细菌感染的方式，从20世纪至今常使用抗生素来治疗。由于抗生素的广泛使用甚至滥用，细菌为了适应环境逐渐对抗菌药物产生抵抗性，据刘军军研究报道，从上海市水产品中的238份南美白对虾样品中总共分离出118株副溶血弧菌(Vibrio parahaemobyticus)和214株霍乱弧菌，其中，副溶血弧菌对抗生素的耐药性达到了78.4%，霍乱弧菌对抗生素耐药性达到了81.8%。据报道，采用生物拮抗的方式，拮抗菌可以在同一生态位中，利用不同微生物间出现生长抑制的现象与病原菌相互制约、相互排斥、相互抵抗，即可拮抗病原菌还可降低病原菌的耐药性。例如，Ongena等研究发现，拮抗菌可以通过分泌多种抑菌物质，如抗菌肽、抗菌蛋白和脂肽类等物质拮抗病原微生物，刘晓铃研究报道，假交替单胞菌J-13的发酵液和菌体对溶藻弧菌、副溶血性弧菌以及灿烂弧菌均呈现出抑制效，并且当假交替单胞菌菌体参与其中时，抑菌活性更为显著。郝彦利研究发现，从东海海水中分离筛选到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的发酵液在抑制副溶血弧菌方面有良好的效果。付欢等和王青华等研究表明，从海洋中分离得到的贝莱斯芽孢杆菌(Bacilus velezensis)的枯草杆菌素可以抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶藻弧菌和副溶血弧菌等多种病原菌。Ren等研究表明，假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)发酵液可以有效抑制哈维氏弧菌对石斑鱼器官的损害。张营从土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌的抗菌蛋白可以抑制橡胶树褐根病菌生长。然而，贝莱斯芽孢杆菌分泌的抗菌蛋白对哈维氏弧菌预防和治疗的相关研究较少。亟待挖掘海洋微生物资源，用来缓解海水养殖业面临的病害问题。

为了水产养殖的绿色健康发展，有必要从海水中筛选具有显著拮抗水产病原菌一哈维氏弧菌的贝莱斯芽孢杆菌，并分离出贝莱斯芽孢杆菌的抑菌物质。为此，本研究从海南省三亚蜈支洲岛的海水中筛选出1株对哈维氏弧菌拮抗效果显著的拮抗菌BS2-7，并研究了BS2-7抗菌物质生产的最适条件，如发酵温度、发酵时间和发酵培养基。研究拮抗菌密度、紫外线照射、孵育温度和孵育酸碱度对抑菌物质抑菌活性的影响。研究不同梯度的硫酸铵药品盐析出粗蛋白对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌抑菌活性影响。研究结果可为治疗哈维氏弧菌、欧文氏弧菌引发的疾病，研发益生菌制剂提供样本支撑和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验菌株和试剂 

供试菌株：从海南省三亚市蜈支洲岛海水中初步筛选出14株备选菌株，储存于海南大学微生物资源开发与利用课题组的-80℃冰箱中。

指示菌株：哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、欧文氏弧菌(Vibrio owensii)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、坎贝氏弧菌(Vibrio campbelli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、短芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)等 11种指示菌株被储存于海南大学微生物资源开发与利用课题组-80℃冰箱中。供试培养基：2216E液体培养基、2216E固体培养基、LB液体培养基、LB固体培养基。供试试剂：PBS缓冲液、硫酸铵药品、细菌DNA提取试剂盒、BCA总蛋白测定试剂盒(南京建成，A045-4)、雅酶一步法PAGE凝胶快速制备试剂盒。

1.2 实验方法

1.2.1 哈维氏弧菌拮抗菌的筛选 

菌株的活化：取-80℃超低温冰箱保存的14株备选菌株和哈维氏弧菌保种液，使用接种棒在2216E固体培养基上划线，倒置在恒温培养箱中30℃培养24h，待长出单菌落。挑取单菌落接种至装有2216E液体培养基的三角瓶中，180r·min-1、30℃活化24h，稀释至1×108 CFU·mL-1后，用于后续实验。

拮抗菌的筛选：活化分离出的14株备选菌株菌液使用超低温离心机，10000r·min-1、4℃离心20min，取其上清液用无菌0.22μm滤膜过滤。得到14株备选菌株的无细胞发酵上清液。以哈维氏弧菌为指示菌，取100μL哈维氏弧菌菌液在2216E固体培养基上涂布，菌密度为1×108 CFU·mL-1，通过打孔扩散法(100μL·孔-1测量抑菌圈直径进行筛选。每个试验做3个重复。根据抑菌圈直径挑选拮抗哈维氏弧菌效果最好的菌株进行后续实验，打孔法参考安相茹等的方法。

1.2.2 哈维氏弧菌拮抗菌BS2-7鉴定 

菌落形态观察：挑取对哈维氏弧菌具有显著拮抗作用的拮抗菌，在2216E培养基上划线分离培养24h，观察菌落形态，包括菌落大小、形态、颜色、透明度、边缘结构、表面光滑度、菌落表面状态。通过扫描电镜(Verios G4UC，赛默飞)观察拮抗菌微观结构。分子生物学鉴定：挑取单菌落接种于2216E培养基中，在摇床中180r·min-1、30℃培养10h，菌株OD600值为0.18，10000r·min-1离心20min，收集BS2-7菌株菌体送至美吉生物公司进行全基因组测序。将拮抗菌的全基因组基因序列与GenBank中已知的核酸序列进行Blast分析，挑选同源性较高的序列在ClusterX软件中完成序列比对，比对结束后使用MEGA7.0软件进行系统发育树分析，采用邻接法构建系统发育树。

1.2.3 BS2-7无细胞上清液的抗菌谱实验 

将11种指示菌菌株和BS2-7拮抗菌通过平板划线活化，挑取单菌落接种于2216E液体培养基中培养24h，使用超低温高速离心机(10000r·min-1、20min、4℃)去除BS2-7菌株菌体，使用0.22μm滤膜过滤残留菌体，保留上清液，使用移液枪移取11种指示菌株100μL原菌液(1×108 CFU·mL-1)到2216E固体平板上，使用涂布棒将2216E固体平板上的指示菌菌液涂干，使用打孔器在培养基上进行打孔，向孔中加入100μL BS2-7无细胞发酵上清液与11种指示菌进行平板对峙，通过测量抑菌直径验证BS2-7菌株对11种指示菌的抑菌活性，挑选拮抗活性最强的指示菌进行后续实验。

1.2.4 上清液对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌最佳抑菌密度测定 

按照上述方法获得BS2-7菌株无细胞发酵上清液，以哈维氏弧菌、欧文氏弧菌为指示菌，向孔中加入100μL无细胞发酵上清液，拮抗菌菌株密度为1×108 CFU·mL-1，与1×104、1×105、1×106，1×107、1×108 CFU·mL－1的欧文氏弧菌和哈维氏弧菌进行平板对峙试验，通过打孔法测量抑菌直径比较上清液对不同密度的哈维氏弧菌和欧文氏弧菌的抑菌活性，每个试验做3个重复。

1.2.5 上清液抗菌物质的稳定生产条件实验

不同发酵时间对上清液中抑菌物质拮抗效果的影响实验：将BS2-7菌株的单菌落接种到装有2216E液体－培养基的100mL离心管中，在摇床中培养时间设置为8、10，16，18，21、24h，(30℃、180r·min-1)，每个时间段拿出3管离心管，待到24h全部拿出，使用离心机去除菌体，保留上清液，通过打孔法测量抑菌直径大小比较不同发酵时间的上清液对哈维氏弧菌和欧文氏弧菌的抑菌活性，每个试验做3个重复。

不同培养基对上清液中抑菌物质拮抗效果的影响实验：培养基为2216E液体培养基、LB液体培养基，将BS2-7菌株单菌落接种于2种培养基中，在摇床中培养24h，第二天去除菌体，通过打孔法测量抑菌直径比较不同培养基发酵的上清液对哈维氏弧菌和欧文氏弧菌的抑菌活性，每个试验做3个重复。不同发酵温度对上清液中抑菌物质拮抗效果的影响实验：温度设置为28、30、35和3℃，将BS2-7 菌株的单菌落接种到装有2216E液体培养基的100mL离心管中，在摇床中培养24h，第二天，通过离心机将4个温度的菌液去除菌体后获得上清液，通过打孔法测量抑菌直径比较不同发酵温度对哈维氏弧菌和欧文氏弧菌的抑菌活性，每个试验做3个重复。

1.2.6 上清液抗菌物质不同条件处理下稳定拮抗实验

不同紫外线照射时长对上清液中抑菌物质拮抗效果的影响实验：按照上述方法获得BS2-7菌株无细胞发酵上清液，将无细胞发酵上清液分装到10mL离心管中，将全部的离心管放在30W紫外灯垂直距离30cm处分别照射1、2，3h，以哈维氏弧菌、欧文氏弧菌为指示菌，以未处理的上清液作为对照，通过打孔法测量抑菌直径对比上清液在不同紫外线照射时间下对哈维氏弧菌和欧文氏弧菌的抑菌活性，每个试验做3个重复。

不同pH孵育对上清液中抑菌物质拮抗效果的影响实验：按照上述方法获得BS2-7菌株无细胞发酵上清液，将无细胞发酵上清液分装到9个100mL的锥形瓶中，每个锥形瓶装有40mL上清液，用浓度为1 mol·L-1的NaOH溶液和浓度为1mol·L-1的HCL溶液调节上清液的pH，使上清液的pH值分别在3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00，9.00，10.00条件下孵育1h，未处理的对照样品则25℃保存1h，1h后将上清液的pH调回其初始pH6.10，通过打孔法测量抑菌直径对比上清液在不同酸碱度孵育下对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的抑菌活性，每个试验做3个重复。参考郝彦利的方法。不同温度孵育对发酵上清液中抑菌物质拮抗效果的影响实验：按照上述方法获得BS2-7菌株无细胞发酵上清液。将无细胞发酵上清液分装到9个10mL的离心管中，将离心管置于10、20、30、40、50、60、70和80℃的水浴锅中水浴1h，常温放置1h的上清液为对照，通过打孔法测量抑菌直径对比上清液在不同温度孵育下对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的抑菌活性，每个试验做3个重复。

1.2.7 上清液抗菌物质初步鉴定

在500mL的无细胞发酵上清液中缓慢加入硫酸铵药品至终饱和度为70%，用磁力搅拌器在常温下缓慢搅拌至全部溶解后，通过低温高速离心机(20min、10000r·min-1、4℃)将蛋白质沉淀与上清液分离，向沉淀中加入10mL纯水将蛋白沉淀溶解，将溶解后蛋白溶液全部转移到10 kDa透析袋中，将透析袋放入装有PBS缓冲液的500mL烧杯中，最后转移到-4℃冰箱中透析18h，以哈维氏弧菌、欧文氏弧菌为指示菌，通过打孔法测量抑菌直径对比发酵上清液、粗蛋白、BS2-7菌体、PBS缓冲液、2216E液体培养基对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的抑菌活性，每个试验做3个重复。

1.2.8 上清液抗菌物质硫酸铵梯度粗分离

按照上述方法收集无细胞发酵上清液，向无细胞发酵上清液中依次添加硫酸铵饱和度为10%、20%、30%、40%、50%、60%和70%所需要的硫酸铵药品提取发酵液中的粗蛋白，每个梯度的上清液都需要在超低温高速离心机中10000r·min-1离心20min将沉淀和上清液分离，向沉淀中加入1mL超纯水溶解后转移到10kDa透析袋中，分离的上清液继续添加硫酸铵药品，按照梯度依次分离出粗蛋白。最后，将不同梯度获得的粗蛋白溶液分别移入到10kDa透析袋中，在PBS缓冲液透析18h过夜。通过打孔法测量抑菌直径对比不同饱和度硫酸铵盐析出的粗蛋白对哈维氏弧菌和欧文氏弧菌的抑菌活性。使用BCA试剂盒检测蛋白密度。将具有活性的抗菌蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)检测。将样本置于振荡器(30r·min-1)上，染色1h后，用脱色液脱色过夜至条带清晰。粗蛋白样品制备参考徐晓裕等的方法。运用Excel软件对实验记录数据进行处理，所有数据均用(平均值方差)表示，通过SPSS(25.0)进行单因素方差分析，使用Graphpadprism8作图软件作出抑菌物质与抑菌圈大小关系的柱状图、折线图。

2 结果与讨论

2.1 拮抗菌的筛选结果 

拮抗菌的筛选结果从表1可知。从14株备选菌株中，筛选到7株具有拮抗效果的菌株，分别为BS2-2、BS2-3、BS2-7、BS2-10、BS2-11、BS2-13 和 BS2-14，抑菌直径分别为(5.18±0.06)、(6.10±0.54)、(16.39±2.68)、(6.74±0.62)、(7.21±0.33)、(9.91±1.67)和(13.27±6.36) mm. 试验结果表明，14株拮抗菌中，BS2-7发酵上清液拮抗哈维氏弧菌的效果最强，因此，选用BS2-7菌株进行后续实验。

表1 拮抗菌筛选结果

注：“-”表示无抑菌圈。

2.2 哈维氏弧菌拮抗菌的鉴定结果

形态学鉴定结果见图1a，BS2-7菌落隆起中间凹陷，边缘不规则，表面褶皱偏湿润，白色至浅黄色不透明；扫描电镜观察鉴定结果见图1b，BS2-7菌株呈柱状；分子生物学鉴定结果见图1c，BS2-7菌株全基因组测序结果鉴定表明BS2-7菌株为贝莱斯芽孢杆菌，BS2-7菌株的全基因组结果上传至NCBI基因库(登录号：CP170168)。与已登录的该属的其他标准菌株序列进行Blast分析并构建系统发育树，BS2-7和贝莱斯芽孢杆菌亲缘关系最近。

2.3 BS2-7无细胞上清液的抗菌谱试验结果

抗菌谱试验结果见表2。BS2-7菌株的无菌发酵上清液对11株指示菌中的哈维氏弧菌、欧文氏弧菌拮抗作用较强，对副溶血弧菌、高地芽孢杆菌拮抗效果较弱，对哈维氏弧菌原菌液(1×108CFU·mL-1)的抑菌直径为(15.94±1.40)mm，对欧文氏弧菌原菌液(1×108CFU·mL-1)的抑菌直径为(21.48±8.82)mm，对副溶血弧菌原菌液(1×108CFU·mL-1)的抑菌直径为(6.28±0.52)mm，对高地芽孢杆菌原菌液(1×108CFU·mL-1)的抑菌直径为(11.85±1.24)mm，对其余7种指示菌无拮抗作用。

表2上清液的抗菌谱结果

注：“－”表示无抑菌圈。

2.4 上清液对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌最佳抑菌密度结果

上清液对不同密度的哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的最佳抑菌结果见图2a和图2c。当欧文氏弧菌的密度为1×104CFU·mL-1时，抑菌物质活性最高，抑菌直径为(31.13±4.46)mm。其次为1×105、1×106、1×107和1×108CFU·mL-1，抑菌直径分别为(29.59±0.50)、( 22.59±3.37)、( 23.37±1.71)和( 16.35±3.54)mm。当哈维氏弧菌的密度为1×104CFU·mL-1时，抑菌物质活性最高，抑菌直径为(23.49±1.79)mm。其次为1×105、1×106、1×107和1×108CFU·mL-1，抑菌直径分别为(22.94±2.87)、(24.83±4.21)、(18.77±0.38)和(15.83±0.59)mm。试验结果表明，哈维氏弧菌密度与欧文氏弧菌的密度对上清液中抑菌物质的抑菌活性具有显著性影响(P<0.05)。无菌上清液中抑菌物质的抑菌活性随着欧文氏弧菌、哈维氏弧菌的密度隆低，呈现出上升趋势。

2.5 上清液抗菌物质的稳定生产条件试验结果

(1)不同发酵时间下的上清液抑菌物质对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的抑菌活性实验结果见图3a和图3b。BS2-7菌株发酵时间为21、24h，上清液抑菌物质对欧文氏弧菌(1×105CFU·mL-1)具有较强的抑菌活性，抑菌直径分别为(23.43±1.62)、(28.09±2.25)mm。发酵时间为8、10、16、18h时，上清液对欧文氏弧菌没有抑菌活性，BS2-7菌株发酵时间为18、21、24h，上清液抑菌物质对哈维氏弧菌(1×105CFU·mL-1)具有较强的抑菌活性，抑菌直径分别为(29.11±3.72)、(19.92±1.79)和(20.88±2.11)mm。发酵时间为8、10、16h时，抑菌物质对哈维氏弧菌没有抑菌活性。试验结果说明，不同发酵时间下，抑菌物质对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的抑菌活性具有显著性影响(P<0.05)。拮抗菌发酵时间在18h前，上清液中抑菌物质对哈维氏弧菌无拮抗作用。拮抗菌发酵时间在21h前，上清液中抑菌物质对欧文氏弧菌无拮抗作用。

(2)不同培养基发酵下的上清液中抑菌物质对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的抑菌活性实验结果见图3c。2216E培养基发酵的上清液抑菌物质对哈维氏弧菌和欧文氏弧菌(1×105CFU·mL-1)的抑菌直径分别为(27.69±4.15)、(25.24±0.74)mm。LB培养基发酵的上清液抑菌物质对哈维氏弧菌和欧文氏弧菌的抑菌直径分别为(21.23±4.20)、(25.04±7.64)mm。试验结果说明，不同培养基发酵产生的抑菌物质对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的抑菌活性无显著性影响(P>0.05)。

(3)不同发酵温度下的上清液抑菌物质对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌抑菌活性试验结果见图3d和图3e。发酵温度为30℃时，抑菌物质对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌(1×105CFU·mL-1)的拮抗效果最强，抑菌直径分别为(19.32±0.95)、(16.17±0.48)mm，发酵温度为35、37℃时的抑菌物质对哈维氏弧菌，抑菌直径分别为(18.11±0.49)、(17.04±0.75)mm，发酵温度为28℃时，抑菌效果最弱，抑菌直径为(15.52±0.50)mm。发酵温度为28、35℃时的抑菌物质对欧文氏弧菌的抑菌直径分别为(15.40±0.73)、(14.07±0.13)mm，发酵温度为37℃时，抑菌效果最弱，抑菌直径为(11.66±0.58)mm。试验结果表明，不同发酵温度生产的抑菌物质对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌抑菌活性无显著性影响(P>0.05)。

2.6 上清液抗菌物质稳定性试验结果

(1)不同pH环境孵育下，上清液中抑菌物质对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的抑菌活性的影响实验结果见图4a和图4b。将上清液pH值调节为3.00、4.00、9.00、10.00的环境中孵育1h，实验组中的抑菌物质丧失了对哈维氏弧菌的抑菌活性，上清液pH值调节为5.00、6.00、7.00、8.00的环境中孵育1h，上清液中抑菌物质对哈维氏弧菌的抑菌活性低于对照组的抑菌活性。对照组的抑菌直径为(20.73±0.31)mm，实验组中的抑菌直径分别为(13.21±0.65)、(15.57±0.62)，(12.57±0.86)、(11.48±0.61)mm。将上清液pH值调节为3.00、4.00、10.00的环境中孵育1h，上清液中抑菌物质丧失了对欧文氏弧菌的抑菌活性。将上清液pH值调节为5.00、6.00、7.00，8.00、9.00的环境中孵育1h，上清液中抑菌物质对欧文氏弧菌的抑菌活性低于对照组的抑菌活性。对照组的抑菌直径为(16.25±0.36)mm，实验组中的抑菌直径分别为(12.35±0.33)，(11.04±0.55)，(13.77±0.11)，(12.2±0.65)，(12.32±0.30)mm。试验结果表明，不同pH孵育显著影响上清液中抑菌物质对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的抑菌活性(P<0.05)。

(2)不同时长的紫外线照射下，上清液中抑菌物质对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的抑菌活性结果见图4c。随着紫外线照射上清液的时间延长，上清液中抑菌物质对哈维氏弧菌的抑菌活性呈下降趋势，未紫外处理过的上清液的抑菌活性高于紫外处理组的上清液的抑菌活性。实验组中紫外照射时间短的上清液抑菌活性高于紫外照射时间长的抑菌活性。对照组的抑菌直径为(28.46±1.28)mm，实验组的抑菌直径分别为(21.83±1.48)、(13.37±1.66)、(17.32±4.84)mm。随着紫外线照射上清液时间延长，上清液中抑菌物质对欧文氏弧菌的抑菌活性呈下降后丧失的趋势。未紫外处理过的上清液的抑菌活性高于紫外处理过的上清液的抑菌活性，实验组中紫外照射时间短的上清液的抑菌活性高于紫外照射时间长的抑菌活性。对照组的抑菌直径为(31.80±6.47)mm，实验组的抑菌直径为(26.51±4.56)mm。试验结果表明，不同时长的紫外线照射下，上清液中抑菌物质对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的抑菌活性具有显著性影响(P<0.05)。

(3)不同孵育温度下，上清液中抑菌物质对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的抑菌活性结果见图4d和图4e。上清液在10、20、30和40℃的温度下孵育1h后，上清液中抑菌物质对哈维氏弧菌仍具有很高的抑菌活性，抑菌直径分别为(19.43±2.88)、(20.73±0.37)、(23.85±6.16)、(26.19±1.11) mm。上清液在50、60、70和80℃的温度下孵育1h，抑菌活性较弱基本丧失，抑菌直径分别为(5.78±0.36)、(5.92±0.48)、(6.77±0.49)、(5.24±0.08)mm。常温放置的上清液抑菌直径为(22.94±2.87)mm。上清液在10，20、30和40℃的温度下孵育1h后，上清液中抑菌物质对欧文氏弧菌仍具有很高的抑菌活性，抑菌直径分别为(16.65±1.12)，(24.08±2.17)，(28.8±2.98)，(19.88±1.72)mm。 上清液在50℃下孵育1 h后，抑菌活性基本丧失。上清液在60、70、80℃的温度下孵育1h后，抑菌活性较弱，抑菌直径分别为(6.21±0.13)、(5.78±1.20)、(10.14±0.87)mm。常温放置的上清液抑菌直径为(29.59±0.50)mm。试验结果表明，不同孵育温度下，上清液抑菌物质对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的抑菌活性具有显著性影响(P<0.05)。

2.7 上清液中抗菌物质的初步鉴定结果

BS2-7菌株上清液抑菌物质的初步鉴定结果见图5。向发酵上清液添加硫酸铵药品盐析获得的抗菌粗蛋白对哈维氏弧菌和欧文氏弧菌均具有抑菌活性，抑菌直径分别为(16.39±3.28)，29.09±4.35），(25.24±0.92)，(22.88±1.58)mm。BS2-7 菌体，PBS 缓冲液、2216E 液体培养基对哈维氏弧菌和欧文氏弧菌均没有抑菌活性。试验结果表明：2216E培养基、PBS缓冲液和拮抗菌菌体对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的没有抑菌效果，上清液中由细胞内分泌到细胞外蛋白产物才是主要抑菌物质。

2.8 上清液抗菌蛋白硫酸铵粗分离结果

不同硫酸铵梯度盐析出的粗蛋白对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的抑菌活性见图6a和图6d。7个梯度的粗蛋白组分中，其中只有饱和度为10%、20%的粗蛋白对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌具有抑菌活性。10%、20%组分中的粗蛋白对哈维氏弧菌的抑菌直径分别为(21.29±0.90)、(18.03±3.84)mm。10%，20%粗蛋白对欧文氏弧菌的抑菌直径分别为(27.20±0.33)、(13.97±0.14)mm。其余5个梯度的粗蛋白对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌均没有抑菌活性。试验结果表明，不同梯度的粗蛋白对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的抑菌活性具有显著性影响(P<0.05)。

SDS-PAGE分离结果如图6c所示，泳道1可观察到10%粗蛋白能分离出1个较明亮蛋白条带，分子量在55～70kDa之间。泳道2可观察到20%粗蛋白能分离出3个较明亮蛋白条带，分子量分别在40～55kDa，35～40kDa，25～35kDa 之间。

3 讨论

抗生素在水生生物疾病防治过程中大量使用和滥用，病原微生物为了适应环境，不仅对抗生素产生耐药性，而且会对环境以及人类的健康造成巨大威胁。贝莱斯芽孢杆菌通过分泌酶、抗菌蛋白等活性物质改变病原菌的细胞质膜的结构，引起细胞死亡的作用机制，降低了病原菌的耐药性，从而被作为一种新型生防微生物因子广泛研究。

关于贝莱斯芽孢杆菌的病害防治研究，大量学者聚焦于植物病原菌，而防治水产病原菌的研究相对匮乏。已有研究报道中，安相茹表明贝莱斯芽孢杆菌C2-1对大口黑鲈维氏气单胞菌(Aeromonas Veroni)具有显著的拮抗作用。李张蝉等从健康大黄鱼肠道中分离出2株贝莱斯芽孢杆菌P1-17和P2-33，对杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicid)、溶藻弧菌、哈维氏弧菌和美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)等多种水产病原菌均有拮抗作用。周一凡研究表明贝莱斯芽孢杆菌CPA1-1能够有效提高罗氏沼虾抗病原非01/O139群霍乱弧菌的感染，提高罗氏沼虾成活率。任竹玲从罗非鱼肠道中分离出的贝莱斯芽孢杆菌G45，在拌料连续投喂罗非鱼10周后，罗非鱼感染舒伯特气单胞菌(Aeromonas schuberti)的死亡率显著降低。这些研究都证明贝莱斯芽孢杆菌是水产养殖中病害防控的潜在益生菌和生防菌。

野生菌株分泌的天然抗菌物质含量较低，本研究通过发酵温度、发酵时间和发酵培养基分析天然抗菌物质的高效生产条件。实验结果表明，拮抗菌发酵温度为30℃，在2216E培养基中发酵时间超过21h，分泌到胞外的拮抗物质对哈维氏弧菌和欧文氏弧菌的抑菌活性较好。

病原菌的密度为1×105CFU·mL-1比1×108CFU·mL-1更能直观地观察到抑菌圈的大小变化来分析抑菌物质的稳定性。因此，本研究通过不同孵育温度、不同孵育酸碱度和不同紫外照射时间，分析贝莱斯芽孢杆菌BS2-7抑菌物质的稳定性，病原菌密度均为1×105CFU·mL-1。实验数据表明，抑菌物质应用到10～40℃水体温度，5～8的酸碱度范围，紫外照射时间为1h的养殖水体中，对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌均具有较高的抑菌活性。与王青华等筛选到的贝莱斯芽孢杆菌DH82孵育温度达到80、100℃时，粗酶液对迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella trda)仍然保持较高抑菌活性结论不一致，与粗酶液在弱酸弱碱下对病原菌抑菌效果相对减弱相一致。与刘妮等筛选出的枯草芽孢杆菌斯氏亚种 Bspi2104，随着紫外照射时间的增加Bspi2104对病原菌的抑菌活性无影响不一致。Cho等研究表明紫外照射会破坏蛋白质分子的天然状态，会造成多肽链的初始断裂以及蛋白质分子交联和聚集。紫外照射可能改变了抗菌蛋白对哈维氏弧菌和欧文氏弧菌结合位点的氨基酸序列，以至于抑菌活性降低和丧失。BS2-7菌株的抗菌物质鉴定实验中，由于BS2-7无细胞上清液中连续添加硫酸铵至饱和度为80%时，硫酸铵固体溶解速率较慢，因此，最终添加硫酸铵药品饱和度达到70%。实验结果表明，由于硫酸铵－蛋白沉淀对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌具有抑菌活性，抑菌物质可能为胞外蛋白，进一步的活性追踪显示饱和度为10%、20%的硫酸铵沉淀具有抑菌活性。杨胜清等同样从贝莱斯芽孢杆菌中，通过添加硫酸铵药品，成功从饱和度为80%的组分中分离纯化出分子量为20.1kDa的蛋白。廖富蘋等还说明了抗菌蛋白其独特的杀菌机制，不易引起病原菌产生耐药性，是一种会自行降解的水产病原体拮抗剂。本文的研究结果为降低使用抗生素药品防治弧菌病提供了样本支持和理论参考。但是，对哈维氏弧菌和欧文氏弧菌具有拮抗作用的蛋白种类还待进一步研究。

4 结论

本文筛选出一株对哈维氏弧菌、欧文氏弧菌拮抗效果较好的菌株BS2-7，通过全基因组基因比对结果鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。BS2-7抗菌物质活性高，其活性物质耐弱酸弱碱，在40℃以下稳定；BS2-7对水产病原菌哈维氏弧菌、欧文氏弧菌表现出拮抗活性，抑菌能力强，通过抑菌物质确认以及硫酸铵粗分离初步鉴定该物质可能为抗菌蛋白，BS2-7分泌的抑菌物质可在哈维氏弧菌病暴发阶段，提前发酵该菌株，将该菌株的上清液拌料投喂，可合理降低哈维氏弧菌、欧文氏弧菌的密度、提高水产养殖动物的存活率，有望开发成微生态制剂产品。

参考文献：略。

作者：叶绵权，王欣怡等2025年10月21日网络首发于《海南大学学报（自然科学版中英文）》