工程微生物防治研发进展及在水产养殖中开发前景分析
摘要：抗生素以其廉价和一定有效性，依然是全球疾病治疗的首选。如今，我国抗生素使用量占亚太地区所有国家使用量的50%以上，其中在水产养殖的用量不容忽视，耐药性问题已给我国水产养殖业造成巨大经济损失。抗生素治疗替代策略在学术界一直颇受关注，然而，天然药物在体内的治疗过程存在稳定性差、特异性低、给药剂量难以把控等一系列问题，导致天然药物开发失败或优化后成本过高。分子生物学和基因组学的快速发展逐步揭示了微生物在分子水平上的执行机制和合成途径，促进了“微生物细胞工厂”的开发。目前，已报道大量工程化微生物被赋予有效的疾病诊断和治疗的性能，本综述回顾了工程微生物在诊断和治疗炎症、病原微生物感染和癌症方面的研究进展，并进一步分析了工程微生物在水产养殖中的开发前景和安全性，为水产疾病防控提供新思路。
关键词：合成生物学；水产养殖；工程微生物；疾病治疗；污染控制
随着我国居民对生活质量需求的提高，水产品因含有大量优质蛋白质而受到消费者广泛关注与喜爱，水产养殖业快速发展。然而，水产养殖中病害频发给养殖户带来了巨大困扰，并造成巨大的经济损失。抗生素作为主要的水产病害预防与治疗药物，在水产养殖中的用量不容忽视，而耐药菌和药物残留的产生显示了抗生素的局限性，因此急需开发抗生素治疗替代策略。如今，中草药、益生菌及噬菌体被认为是主要的抗生素替代药物，并已产生大量的学术成果。然而，这些学术成果的应用转化过程一直不理想，究其原因在于实验室疗效无法在田间临床中得到较好的复制，如药物在田间稳定性差、特异性低、药物剂量难以把控等问题。此外，过去的物理和化学治理方法经常存在高成本或产生新残留污染物等问题，已成为了养殖户的一大负担。
生物技术的进步揭示了越来越多的基因元器件、模块及复杂的途径网络，促使了合成生物学概念的出现。合成生物学是指人们将这些基因元器件及其原理充分运用于生物体，以达到人为的目标设计、合成、改造并创造出“新生命”，从而让生物来完成人类设想的各种目的。工程微生物就是运用合成生物学技术对微生物进行定向改造，使微生物具有一些新的功能或原有的功能被更改，从而达到更佳应用效果的微生物。工程微生物已被广泛开发于感知、控制和响应相应的疾病发生，成为癌症、糖尿病、炎症性肠病和微生物感染等疾病的潜在诊断和治疗的活微生物药物。工程微生物概念的出现成为了医学治疗的新策略，对多种疾病展现出巨大的应用前景。因此，工程微生物所具有的高效特异性诊断和治疗疾病以及给药宿主的优势或将成为解决现有药物不足之处的新型药物。然而，工程微生物的安全性一直存在疑问，且一些问题仍未解决，限制着工程微生物的发展。本综述围绕工程微生物的研发进展、水产养殖中的应用前景和安全性顾虑进行分析，从而为水产新药开发提供参考。
1 工程微生物研发进展
1.1 工程微生物诊断和治疗炎症
作为活微生物治疗药物，安全性是首要考虑的因素，益生菌被首选成了进行改造的目标并被广泛使用，如大肠杆菌(Escherichia coli Nissle，ECN)、乳酸乳球菌(Lactococcuus lactis)和芽孢杆菌(Bacillus)类等。目前已有较多工程微生物治疗炎症性肠道疾病的研究，ZOU等改造ECN使其对炎症的标志物硫代硫酸盐的水平做出反应，并进一步启动免疫调节剂AvCystatin的表达和释放，结果显示其对患有结肠炎的小鼠具有显著的体内治疗效果。WO0等研发了一套能同时响应肠道炎症的生物标志物硫代硫酸盐和硝酸盐的生物传感器，将其转入ECN后能灵敏和特异地诊断肠道炎症，为相关疾病提供了无创的诊断途径。FARRAR等开发了能够响应木聚糖而转录表达小鼠白细胞介素2的工程益生菌卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)，指示为有前景的炎症性肠道疾病的新型长期免疫疗法。HAMADY等进一步将用于治疗炎症性肠道疾病的转化生长因子-β加入卵形拟杆菌木聚糖操纵子中的木聚糖酶启动子的下游，该回路显示能够响应多糖木聚糖而表达转化生长因子-β二聚体，工程菌施予患结肠炎小鼠后，病理组织学分析显示小鼠炎症显著减少38%。此外，基于硫代硫酸盐和连四硫酸盐作为信号分子的传感器也被应用于诊断和治疗体内炎症。这些研究揭示了活性工程微生物开发于治疗炎症性肠道疾病的高效性和特异性。
1.2 工程微生物防控病原菌感染
病原菌的体内感染给医学带来了巨大挑战，抗生素一直是对抗病原菌的首选，然而耐药菌的出现指示抗生素的局限性，并因此导致全球每年多达上百万人死亡。随着抗菌肽、细菌素以及噬菌体裂解酶等多肽类生物活性物质显著抵抗或杀灭微生物的能力被发现，该多肽类生物活性物质被逐渐认为是有前景的抗生素替代药物。然而，该类药物的活性多肽在环境中极易降解失活，从而失去抗菌功效，其给药方式成为难题。此外，非特异性给药会导致非目标菌类受到影响，因此高效特异性的靶向病原微生物也成为了给药方式的一项挑战。工程微生物能够通过构建相关响应合成线路感应病原微生物的存在进而表达抗菌多肽，为抗菌多肽的给药方式提供了高效的途径。
如今，已报道有多种工程微生物被开发用于防控病原菌感染。JAYARAMAN等基于霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的群体感应回路，能特异性地响应霍乱弧菌群体感应信号分子而转录表达杀伤蛋白Art-085，在工程菌自裂解后进一步释放Art-085而在体外100%杀灭霍乱弧菌。MA0等以乳酸乳杆菌(Lactobacillus)作为工程菌开发了类似群体感应回路，能特异性地检测到小鼠体内霍乱弧菌的感染。DUAN等开发的工程化ECN能持续表达霍乱弧菌自诱导剂1也显示具有显著降低霍乱弧菌毒素对宿主造成的危害，并将霍乱弧菌感染小鼠的成活率提高了77%。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureuus)能感染宿主的血液、呼吸道，尤其是胃肠道，是一种广泛存在于环境中的潜在致病菌。PIPIYA等针对金黄色葡萄球菌开发了一株工程毕赤酵母，该菌能表达细菌素溶葡萄球菌酶，显示体外33℃共培养下能完全杀灭金黄色葡萄球菌，但未报道体内治疗效果。VICTORIA等开发了一株工程肺炎支原体能同时表达抗生物膜肽分散素B及细菌素溶葡萄球菌酶，并将两个蛋白与内源性信号肽融合表达，使其分泌到胞外，有效地去除了金黄色葡萄球菌的生物膜及杀死金黄色葡萄球菌。产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)广泛感染于畜禽的胃肠道中，导致人类和畜禽引起食物中毒、肠炎和呼吸道感染等症状，已成为食源性疾病发生的主要病原菌。已有研究采用益生菌干酪乳杆菌(Lactobacilluus casei)改造具有表达产气英膜梭菌α、ε、β1和β2毒素的类毒素的模块，该工程菌免疫兔子后能提高80%患产气荚膜梭菌病兔子的存活率。包括表达产气荚膜梭菌α-类毒ε素和成孔毒素NetB的工程化鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、表达产气荚膜梭菌肠毒素CPE的布拉氏酵母菌及缺乏NetB毒素的减毒产气荚膜梭菌疫苗免疫后均显示能减少宿主对产气荚膜梭菌的感染。此外，益生菌约氏乳杆菌被改造成能够合成并分泌具有抗产气荚膜梭菌的内溶素，显示在体外工程化益生菌裂解产气荚膜梭菌的能力提高。虽然杀伤性工程菌约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)未显示体内治疗功效，但综合已报道的针对其他致病菌的工程微生物疗效，治疗产气荚膜梭菌的工程微生物的开发仍具有巨大的前景。
当然，以病原菌为靶标的工程微生物还有很多，如改造能够表达抗体中和艰难梭菌(Clostridioides difficile)毒素的工程益生菌、能够通过特异性识别铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应信号
分子进而产生细菌素杀伤铜绿假单胞菌的工程ECN等都指示了工程微生物在根除病原菌方面的巨大优势，工程微生物或将成为未来治疗发展的新趋势。
1.3 工程微生物诊断和治疗癌症
多种细菌在19世纪就已被认为对癌症治疗具有应用前景，能够直接作为肿瘤靶向载体或者直接作为活性药物。如今，合成生物学技术的发展给细菌靶向肿瘤细胞提供了更先进的“装备”，被改造的工程微生物能够更精准地靶向肿瘤细胞和释放药物，提高了细菌治疗癌症的疗效和安全性。TAN等将减毒鼠伤寒沙门氏菌改造成能够表达溶细胞素A(ClyA)的工程微生物，结果显示静脉注射工程菌后其能特异性地在肿瘤组织中积累进而释放ClyA杀伤癌基质细胞和癌细胞，指示能显著提高癌症疗效。TETSUHIRO等对ECN进行改造，将其改造成可控的表达表面荚膜多糖的工程微生物，从而暂时减少宿主的免疫攻击和促进ECN大量安全转移至远端肿瘤部位，指示能显著提高疗效。DANIEL等改造ECN使其靶向激活干扰素刺激因子以驱动肿瘤内抗原呈递细胞活化，从而促使肿瘤抗原呈递至效应T细胞以达到治疗肿瘤的效果。CHIEN等研究展示通过基因编程改造具有pH或氧传感器的细菌，其在生理相关的酸性或氧气条件影响下进而驱使其特异性靶向肿瘤区域并增强生长。当然，基于合成生物学技术用于治疗癌症的工程菌株还有很多，但在临床转化过程中仍然还要考虑生物安全与防护的问题。总的来说，细菌作为具有巨大开发价值的活微生物药物，既能作为单一药物也能与其他药物联合使用，这将为肿瘤诊断和治疗提供一个新途径。
2 工程微生物在水产养殖中的开发前景分析
2.1 水污染物控制
大量益生菌已被报道在改善不同水产养殖动物生长性能、提高抗病性和免疫力及调节水质方面发挥着重要作用，有助于减少抗生素给水产养殖带来的副作用。水产益生菌的存在给工程菌的开发提供潜在的底盘细胞，因此，水产养殖中对有害因素的工程菌控制成为可能。
水环境污染一直是水产养殖业面临的一大难题，威胁着水产养殖动物的健康和水产品质量安全。针对于这些环境污染问题，过去的物理或化学治理方法要么成本过高，要么还会引进新的污染物，存在很多的缺陷。工程微生物在控制环境中的重金属、危险化学品、外源性物质和杀虫剂等污染物已被陆续报道。这些工程化微生物一般构建具有能够实时感应环境污染物并表达相应污染物结合或降解多肽的遗传回路，如被报道能实时检测铜离子、铅离子和汞离子而表达金属硫结合蛋白的工程枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，显示在水中对此三种金属离子具有99%以上的去除率。此外，包括一些揭示的芳氧苯氧基丙酸酯类除草剂水解酶feh、有机汞裂解酶MerB和汞还原酶MerA等的编码序列均是用于未来工程微生物开发的潜在“武器库"。因此，工程微生物或将成为新一代水环境污染修复策略，它具有更加安全且能在环境中可控存活和发挥持久功效的潜力。
2.2 疾病防控
工程微生物在抗水产病原微生物方面的潜力是毫无疑问的，其在特异性高效诊断和治疗病原微生物感染方面的能力得到了充分报道。水产病原菌如爱德华氏菌(Edoardsiella ictaluri)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) 和 无乳 链 球 菌 (Streptococcus agalactiae)均被报道具有LuxS/AI-2型群体感应系统，指示这些病原菌能向胞外分泌可用于生物传感器检测的信号分子，因此具备开发工程微生物用于诊断该病原菌存在的潜力。此外，大量针对水产病原菌的抗菌肽已被报道，如对无乳链球菌具有抗菌活性的抗菌肽AureocinA53、对嗜水气单胞菌具有抗菌活性的抗菌肽LJ-hep2，及对爱德华氏菌、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和嗜水气单胞菌等多种水产病原菌具有抗菌活性的人工合成抗菌肽KK16等，这些抗菌肽信息进一步显示工程化微生物开发用于治疗水产病原菌成为可能。因此，上述结果指示工程微生物疗法将有望开发用于高效且特异性靶向治疗水产病原菌疾病。
3 安全隐患及监管现状
微生物疗法无论在实验室还是在临床上都已经展现不可替代的功效，然而，野生型微生物的开发似乎已达到了平台期，急需新微生物治疗策略来应对当下医学无法解决的疾病难题。虽然实验室阶段证明了大量有效的工程微生物疗法，但安全性问题仍需被考虑并克服，提高消费者对基因工程类产品的信任。
工程微生物遗传物质的稳定性需要得到保证，自然条件下微生物的基因突变和遗传物质的外界获取是时常发生的，遗传物质的改变可能带来有害的功能和抗生素耐药性发生的风险。此外，工程微生物携带的人为设计遗传回路若没有得到很好的控制，将有机会转移至其他菌株，尤其是其他病原菌，将增加基因获得性病原菌在环境中的竞争力，给环境带来新的危害。工程微生物整合位点的开发及外源基因线路的基因组整合或许是目前解决遗传物质稳定性的较好的方法，但基因组中目的产物的低表达仍是研究者需要考虑和解决的问题。工程微生物的定植问题也需要进一步进行利害评估，理论上永久定植似乎可以更好地预防和治疗其靶向的疾病，但不可忽视的是宿主多次进行不同工程微生物的治疗将可能彻底改变宿主肠道微生物多样性的结构，这对宿主健康必将是巨大挑战。因此，可控的定植或许是应该考虑的策略，如设计成需要适当外源环境条件干预生存的工程微生物，以可控地调节工程微生物的定植。虽然有研究给工程微生物设计了防逃逸致死机制，以限制工程微生物仅存在患病宿主体内，从而避免其外逃至外界环境中产生未知的影响。然而，开发于控制环境污染物的工程微生物将不可避免进入到环境中，工程微生物对各种环境因素的影响应当具有一定数据支撑。
关于工程微生物转化临床应用的评估程序还需要加快改进，虽然美国在1986年制定了生物技术监管协调框架，陆陆续续在完善，但监管机制一直与科学进步有些不一致。目前，美国生物技术开发商对产品许可需要咨询多达8个机构和办公室及遵守多达15项不同的法律，且还要遵循可能适用于其产品的许多不同的法规和指南。欧盟成员国对活性生物治疗产品的申请也需涉及多个欧盟监管机构及各自成员国内设有的主管机构对申请文件进行一系列的评估，申请文件被要求包含管理和处方信息、产品特性、临床和非临床研究数据，且必须证明在药品生产期间遵守了当地药品生产质量管理规范等。然而，有报道指示欧盟监管部门设立的方案依旧不够完善，无法明确指示活微生物药可能带来的安全危害，而监管机构专业知识的不足是主要的限制因素。这些复杂且不科学的程序阻碍着产品的转化过程，一定程度上增加了消费者对产品存在心理上的顾虑。如今合成生物技术和人工智能的快速发展和融合，许多不可解决的医学难题已经在生物技术产品中有了解决方案，评估流程需要更具适应性和灵活性，以便可以快速地决定批准与否。
4 结论
