枯草芽孢杆菌发酵豆粕产蛋白酶活性的研究

摘 要 采用枯草芽孢杆菌1389发酵豆粕，研究其所产的蛋白酶的活力。运用响应面分析法优化影响发酵的主要因素：接种量、初始pH值、发酵培养基浓度，采用多元二次回归方程拟和上述3因素与蛋白酶活力间的函数关系，确定了枯草芽孢杆菌发酵豆粕产蛋白酶的最佳发酵条件，为枯草芽孢杆菌发酵豆粕产大豆肽的研究提供了相应的工艺参数和一定的依据，有利于提高大豆肽的产率。
关键词 大豆肽；枯草芽孢杆菌1389；蛋白酶；响应面分析
中图分类号 S816.3
大豆肽是比大豆蛋白质更为优质的营养品，已在食品、医学、日用化工等领域中显示出了良好的开发前景。大豆肽的生产主要有酶解法和微生物发酵法。酶解法是在比较温和的条件下进行的，能很好地保存氨基酸的营养价值，而且水解易控制，可定位生产特定的大豆肽。但其缺点是大豆蛋白利用率不高，仅限于少数几种微生物蛋白酶、动物蛋白酶和植物蛋白酶，酶解产肽率相对较低，受外界环境因素影响大，而且成本高，肽酶价格和脱苦成本都相应增加生产成本，不适合工业化生产。微生物发酵法以大豆蛋白或豆粕为原料，应用产蛋白酶的细菌或霉菌，经过发酵作用，得到具有良好功能性与营养特性的大豆肽，且生产成本低，已成为国内外的研究热点。
基于枯草芽孢杆菌是日本传统食品纳豆的主要菌种，本文采用食品级的枯草芽孢杆菌种直接发酵豆粕粉生产大豆肽，代替了传统的酶法水解蛋白方法，不仅在营养价值上具有较大的潜能，而且成本低。枯草芽孢杆菌培养条件粗放，有较丰富的酶系，生长温度范围较宽，有利于常年生产等优点。在枯草芽孢杆菌发酵豆粕过程中，蛋白酶活力影响大豆肽的得率。因此，通过优化发酵条件的研究，为枯草芽孢杆菌发酵豆粕产大豆肽提供相应的工艺参数，有利于提高大豆肽得率。
1 材料与方法
1.1 原料
低温脱脂豆粕：山东万得福集团生产。
1.2 菌种
枯草芽孢杆菌1389：本实验室保存。
1.3 试剂
Folin-酚试剂、三氯乙酸、碳酸钠、乳酸（80%~90%）、乳酸钠、酪素等，除乳酸钠、酪素为化学纯外，其它试剂均为分析纯。
1.4 培养基
斜面培养基：蛋白胨1 g、牛肉提取物0.3 g、NaCl 0.5 g、琼脂2.0 g、蒸馏水100 ml，pH值7.0。
液体种子培养基(营养肉汁培养基)：蛋白胨1 g、牛肉提取物0.3 g、NaCl 0.5 g、蒸馏水100 ml，pH值7.0。
发酵培养基:在250 ml三角瓶中豆粕装量为50 ml。灭菌后接入液体菌种，振荡培养。
1.5 蛋白酶活力测定方法
采用Folin-酚法测定蛋白酶活力。
2 枯草芽孢杆菌发酵豆粕产蛋白酶的发酵条件的优化
2.1 豆粕浓度、pH值、温度、接种量、通气量等对发酵豆粕产蛋白酶的影响
影响枯草芽孢杆菌1389发酵豆粕产蛋白酶的因素很多，如豆粕浓度、pH值、温度、接种量、通气量等。酶制剂的生产是一个好氧过程，在现有的条件下，通风越大，产量就越高，所以本实验所有发酵都采用最大转速200 r/min。由图1可见，通过测定发酵液中蛋白酶酶活随时间的变化趋势证明，当发酵到48 h时，发酵液的酶活力达到最高值，在发酵后阶段，枯草芽孢杆菌开始衰亡，产酶能力下降，酶活力也随之逐渐降低。选择48 h为最佳发酵时间。
其它影响微生物发酵的主要因素与蛋白酶酶活的关系如图2所示。



由图2可以看出，在枯草芽孢杆菌1389发酵豆粕产蛋白酶的过程中，接种量、pH值和豆粕浓度对产蛋白酶的酶活影响较大，变化趋势比较明显；在接种量9.0%～13.0%、pH值7.0～9.0、豆粕浓度4.0%～6.0%范围内蛋白酶酶活都有最大值出现；温度对蛋白酶酶活的影响不太明显，但30 ℃时最高。枯草芽孢杆菌1389所产的蛋白酶基本上是中性或偏碱性的蛋白酶，pH值对发酵的影响最大，在发酵过程中控制pH值至关重要。
2.2 响应面分析设计与结果
根据Box-Behnken的中心组合设计原理，以豆粕浓度、pH值、接种量3个因素为自变量，以根据所测吸光度计算得到的蛋白酶酶活为响应值，设计了3因素3水平共15个试验点的响应面分析试验，其因素水平选取见表1，试验方案与结果见表2。

以X1、X2、X3分别表示接种量、pH值、豆粕浓度3个变量，以Y表示响应值（酶活），经RSA分析，Y与X1、X2、X3的关系可用下列回归方程来表示：Y=a0+a1X1+a2X2+a3X3+a11X12+a22X22+a33X32+a12X1X2+a13X1X3+a23 X2X3。
方程中的各项回归系数具体数值见表3，同时可以得到回归方程的方差分析见表4、表5。

从表4、表5可以看出，方程的F值为9.7，查F分布的临界表，得：f0.01(9,5)=10.2>F>f0.05(9,5)=4.8。说明上述回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其应变量与全体自变量之间的线性关系是显著的；复相关系数的平方R2=0.009 837，这也说明这种试验方法是可靠的。
RSA方法的图形是特定的响应值Y和对应的因素X1、X2、X3构成的1个三维空间在二维面上的等高图,可以直观地反映各因素对响应值的影响,从试验所得的响应面分析图(见图3、图4、图5)上可以找到它们在发酵过程中的相互作用,确认合适的工艺条件。


从响应面分析图3、图4、图5中可以看出，X1（接种量）和X2（pH值）对产酶能力影响较为显著，表现为曲线较陡，X1的最佳值在0.1左右，X2的最佳值在0.1左右，它们代表的pH值和接种量分别在8％和10.1%左右，X3对产酶能力的影响不如前两个因素显著，表现为曲线较为平滑，随其含量的增加而增加，响应值变化较小，其最佳值在0.6左右，它所代表的豆粕浓度在5%左右。根据RSA分析结果，利用计算机软件绘出的响应面分析立体图，3个因素的显著性质在立体图中也可以看出。
为了进一步确证最佳点的值，对RSA回归方程取一阶偏导等于零并整理得：
由以上3个方程解得：X1=0.1、X2=0.2、X3=0.86。
由此可以计算出枯草芽孢杆菌发酵豆粕产蛋白酶的最佳条件是接种量10.5%，起始pH值8.2，豆粕浓度5.7%，发酵温度30 ℃，发酵时间48 h。通过验证试验，得在最佳条件下的蛋白酶酶活为449.2 U/ml，与理论预测值基本一致。
3 结论
通过优化试验,确定枯草芽孢杆菌发酵豆粕所产的蛋白酶酶活为449.2 U/ml,蛋白酶酶活比较高,为枯草芽孢杆菌发酵豆粕产大豆肽提供了相应的工艺参数，有利于提高大豆肽得率。验证试验确定在此条件下大豆肽含量可达16.47 mg/ml。枯草芽孢杆菌发酵豆粕生产大豆肽,可以显著的改善大豆肽的生理特性。