枯草芽孢杆菌DPG-01液体深层通风发酵的研究

王健华
摘 要 以豆饼粉、玉米淀粉为主要发酵原料，根据摇瓶正交试验结果对枯草芽孢杆菌DPG-01在50 L全自动发酵罐条件下液体深层通风发酵的规律进行了深入研究，结果表明：在培养基组成为高温豆饼粉2.2%、尿素0.1%、玉米浆0.15%、玉米淀粉0.85%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.1%、硫酸锰0.02%、消泡剂0.3%、pH值7.5（消前）及培养条件为装填系数60%、温度37 ℃、风比1：0.5、罐压0.05 MPa、搅拌转速210 r/min、发酵周期36 h条件下，发酵水平达到1.2×1010 CFU/ml，芽孢形成率达到95%。
关键词 枯草芽孢杆菌；发酵；微生态
中图分类号 S852.6
抗生素作为饲料添加剂存在的问题主要表现在两个方面：一是抗生素残留污染肉、蛋、奶；二是抗菌素抑制和杀死肠道内的有益菌群，造成肠道正常菌群生态失调，导致疫病的发生，出现二重感染，有害于人畜健康。微生态制剂用于畜禽养殖业可以有效解决以上问题，目前该产业正在迅猛发展。
应用于微生态添加剂的微生物主要包括芽孢菌类、乳酸菌类和酵母菌类，芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌为主。目前国内枯草芽孢杆菌制剂多采用固体发酵方式进行生产。固体发酵具有设备投资低、工艺流程简单等特点，但固体发酵存在过程控制困难、容易出现污染（尤其是遭受噬菌体污染）等，严重影响生产水平和产品质量。
本文在摇瓶正交试验的基础上，对枯草芽孢杆菌DPG-01在50 L全自动发酵罐条件下液体深层通风发酵的规律进行了研究,发酵水平达到1.2×1010 CFU/ml,从而为有效降低生产成本奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
枯草芽孢杆菌DPG-01（Bacillus subtilis）,由河北大学生命科学院提供。
1.1.2 培养基
分离培养基：马铃薯淀粉2%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%，pH值7.0，表压1 kg/cm2下灭菌30 min。
斜面培养基：牛肉膏1%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%，pH值7.0。
液体种子培养基: 葡萄糖5%、牛肉膏1%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%，pH值7.0。
液体深层通风发酵培养基：高温豆饼粉2.2%、尿素0.1%、玉米浆0.15%、玉米淀粉0.85%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.1%、硫酸锰0.02%、消泡剂0.3%，pH值7.5（消前）。
1.1.3 仪器设备
生化培养箱：HPS-250生化培养箱，由哈尔滨东联电子技术开发有限公司生产。
摇床：HZQ-Q振荡器，由哈尔滨东联电子技术开发有限公司生产。
液体深层通风发酵罐：GUJS-50AUTOBIO2000型50 L全自动机械搅拌发酵罐，由镇江东方生物工程设备技术有限公司生产。
生物显微镜：Leica BME生物显微镜，由上海徕卡显微系统有限公司生产。
分光光度计：Spectrum WFJ72可见分光光度计，由上海光谱仪器有限公司生产。
1.2 方法
1.2.1 菌种的制备
① 将枯草芽孢杆菌DPG-01保藏菌种转接于新鲜试管斜面，37 ℃培养24 h。
② 分离培养基采用平板稀释涂布分离法对菌种进行分离、纯化，筛选出的单菌落转接于新鲜试管斜面，37 ℃培养24 h备用。
③ 500 ml三角瓶装入100 ml液体种子培养基，121 ℃灭菌30 min，接入以上培养好的菌种一接种环，温度37 ℃,在转速为210 r/min摇床上震荡培养16 h。
1.2.2 发酵
① 50 L全自动发酵罐中装入发酵培养基，消前体积25 L（消后30 L），121 ℃灭菌30 min。
② 按1%接种量接入液体菌种300 ml。
③ 发酵条件控制，温度(37±0.5) ℃，风比1：0.5，搅拌转速210 r/min，罐压0.05 MPa。
④ 每2 h无菌取样进行以下项目检测：生物量、pH值、镜检、还原糖含量、氨基氮含量。
1.2.3 生物量测定
采用浊度法以OD值间接测定生物量：取1 ml样品并用蒸馏水稀释10倍，分光光度计600 nm以蒸馏水做参比测定吸光度。
1.2.4 还原糖含量测定
采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法测定还原糖含量。
1.2.5 氨基氮含量测定
采用甲醛滴定法测定氨基氮含量。
1.2.6 活菌总数测定
采用平板涂布法测定活菌总数。
2 结果与分析
2.1 液体深层发酵过程中pH值的变化（见图1）

由图1可见， pH值呈现先降后升的规律，pH值在8 h达到最低点（5.78），此后pH值逐渐回升，36 h到达最高点(8.71)。
2.2 液体深层发酵过程中OD值的变化（见图2）

由图2可见，0～6 h为延迟期，6～18 h为对数期，18～32 h为稳定期，32 h以后为衰亡期。
2.3 液体深层发酵过程中还原糖含量的变化(见图3)

由图3可见，0～6 h菌体处于延迟期，还原糖含量变化不大；6～18 h菌体生长进入对数期，还原糖大量消耗；18 h以后还原糖数值趋于稳定。
2.4 液体深层发酵过程中氨基氮含量的变化(见图4)

由图4可见，氨基氮含量在整个发酵过程中呈现波浪状变化规律，分析其原因可能是由于菌体生长过程中受代谢调控作用影响，胞外酶分泌不断变化，同时氨基氮又被菌体生长繁殖所利用，在两种因素的共同作用下而引起氨基氮含量呈波浪状变化规律。
2.5 液体深层发酵过程中芽孢形成率的变化(见图5)
由图5可见，发酵20 h时菌体开始形成芽孢，此时正是菌体生长进入稳定期；30 h时芽孢形成率达到80%左右；32 h时达到最高值95%左右，此时停罐对于枯草芽孢杆菌微生态产品生产是最为有利的。

3 讨论
发酵液可以达到的有效活菌总数对于微生态产品生产意义重大,不但直接影响生产成本,而且对产品质量及实际使用效果起着至关重要的作用。本文以豆饼粉、玉米淀粉为主要发酵原料,根据摇瓶正交试验结果得到的最优化培养基配比,对枯草芽孢杆菌DPG-01在50 L全自动发酵罐上进行的液体深层通风发酵试验表明：发酵水平达到1.2×1010 CFU/ml时，芽孢形成率达到95%。
液体深层通风发酵醪液采用超滤工艺浓缩，然后加入淀粉做为载体，干燥后浓缩菌剂有效活菌总数达到2×108 CFU/g以上，成品室温保存18个月，活菌保存率为82%。
可见，采用液体深层通风发酵生产微生态产品，发酵水平较高且生产稳定，发酵液经后提取成品质量很好，是值得推广的发酵方法。
参考文献
1 诸葛健, 王正祥. 工业微生物实验技术[M]. 轻工业出版社，1994
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