产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定


摘 要 采集健康奶牛的新鲜粪便,利用刚果红平板染色法分离筛选具有产纤维素酶活性的芽孢杆菌,并进行细菌菌落、形态和生化鉴定。结果从牛粪中分离出35株兼性厌氧的芽孢杆菌,利用刚果红鉴别培养基筛选出具有分解纤维素能力的菌株,并测定其水解圈大小,初步筛选出10株纤维素酶高产菌株,并对其进行了种属鉴定:一株为梭状芽孢杆菌,其余9株为芽孢杆菌属细菌。
关键词 纤维素酶;芽孢杆菌;分离;鉴定 
中图分类号 Q814.1
纤维素是植物体的主要成分,是地球上数量最大的可再生性能源物质,利用微生物可将纤维材料转化为饲料、化工等原料。随着能源紧张、环境污染和人口剧增等世界性问题的日趋严重,对绿色生态的呼声越来越高,因此,通过可再生纤维素资源的生物转化生产葡萄糖和乙醇已成为一个十分重要的热门课题。而这一应用的首要前提就是要分离到能够高产纤维素酶、有效分离纤维素的微生物菌种。目前研究较多的是霉菌,其中木霉、曲霉、根霉和青霉具有较强的酶活力,尤以绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉为典型,是目前公认的较好的纤维素酶生产菌[1]。但霉菌为好气性微生物,而饲料发酵、污物的纤维素类分解等都是在少氧或缺氧环境中进行的,故产纤维素酶活高的厌氧及兼性厌氧细菌更具有应用上的现实意义。出芽孢的细菌因芽孢的形成,在耐酸、耐碱、耐高温等方面有明显的优势,更利于实际操作和工业生产,因此成为目前研究产纤维素酶微生物的一个重要方向。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集
从四川农大奶牛场采集健康奶牛新鲜粪便。
1.1.2 培养基[2,3]
1.1.2.1 液体增菌培养基 胰蛋白胨1%、酵母粉0.3%、牛肉浸膏1%、葡萄糖0.5%、可溶性淀粉0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.05%、NaCl 0.5%、无水乙酸钠0.3%、水1 000 ml,pH 值为7.0。
1.1.2.2 菌种纯化培养基 胰蛋白胨1%、酵母粉0.3%、牛肉浸膏1%、葡萄糖0.5%、可溶性淀粉0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.05%、NaCl 0.5%、无水乙酸钠0.3%、CaCO3 0.1%、NaHCO3 0.1%、K2HPO4 0.4%、MgSO4·7H2O 0.05%、(NH4)2SO4 0.1%、MnSO4·H2O 0.02%、琼脂粉1%、水1 000ml,pH值为7.0。
1.1.2.3 CMC-Na培养基[4,5] CMC-Na 1%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.05%、KH2PO4 0.15%、MgSO4 0.02%、NaCl 0.5%、琼脂粉0.8%, pH 值为7.0。
1.1.3 试剂及溶液
0.2%刚果红染液、5%醋酸、1 mol/l NaCl。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离
取新鲜粪便5 g于95 ml灭菌生理盐水中,振荡摇匀,置于80 ℃水浴10 min。按1%接种量接种于增菌肉汤中,37 ℃厌氧培养48 h。取增菌培养后的菌液于分离培养基上划线培养,置于厌氧缸中,37 ℃ 培养48 h后,挑取单个菌落染色镜检,取G+芽孢杆菌继续纯化培养。
1.2.2 纤维素分解菌的筛选及纤维素酶活力的初步测定[6-8]
将分离到的各纯化菌种活化,在CMC-Na平皿上以3点种植,分别培养24、48 h后,采用0.2%刚果红染色30 min,然后依次用蒸馏水和1 mol/l的NaCl彻底洗去染液,再用5%(m /v)的醋酸固定颜色。在菌落周围形成染色圈的菌落证明芽孢杆菌产纤维素酶。用游标卡尺分别测量透明圈直径(H)和菌落直径(C),选择两者比值(H/C)较大的10株菌株进行革兰氏染色,显微镜下观察及生理生化鉴定。
1.2.3 生理生化鉴定
各种生长、生理生化试验均以培养20~24 h的斜面为种子。
除特别说明外,一般形态学观察和生理生化性状试验均参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第9版[9]和《微生物学实验》[10,11]进行属和种的鉴别。
芽孢杆菌主要分5个属,用形态学观察、接触酶试验、硫酸盐还原试验和需氧性试验可以鉴定到属,各属依靠碳水化合物发酵和生化特性可以鉴定到种。
2 结果与分析
2.1 纤维素酶分解菌的筛选及测定结果(见表1)

从牛粪便中筛选到的芽孢杆菌共35株,将纯化的菌种点种于纤维素平板上,经刚果红染色,筛选出产纤维素酶的芽孢杆菌17株,经多次反复试验比较,得出其水解圈大小。
根据刚果红染色结果,初步筛选出A1、B3、C、D2、D3、E1、E2、E3、F、M10株具有较高纤维素分解能力的芽孢杆菌,对其进行生理生化鉴定。
2.2 形态学观察及生理生化鉴定结果
2.2.1 形态学观察
在琼脂平板上培养48 h后,观察细菌菌落的生长特征,并取单个菌落进行革兰氏染色、芽孢特殊染色和伴孢晶体的观察,观察细菌基本形态大小、芽孢生长状况,结果见表2、表3。
2.2.2 生理生化特征
将细菌接种于斜面培养24 h后,采用生理生化试验进行种属间鉴定和属内鉴定。种属间鉴定结果见表4,由表4结果,参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《微生物实验手册》,结合形态学观察结果判定:A1为梭菌属细菌,其余9株为芽孢杆菌属细菌,并以此为依据进行属内鉴定。属内鉴定结果见表5、表6。由表2至表6的结果可以判定:A1为梭菌属的双酶梭菌;B3、D2、E2、E3为凝结芽孢杆菌;C为短小芽孢杆菌;E1为多粘芽孢杆菌;D3为浸麻芽孢杆菌;F为地衣芽孢杆菌;M为短芽孢杆菌。


3 讨论与结论
在地球表面不同环境中生长着不同类型的分解纤维素的微生物,有真菌、细菌、放线菌等。由细菌所产生的纤维素酶一般最适pH值为中性至偏碱性,因为这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱,长期以来没有得到足够的重视。目前的研究多集中在真菌上,因为真菌多为好气性微生物,但从环境保护等方面的应用来看,对一些厌氧菌和兼性厌氧菌的研究是很重要的,因为污物的纤维素类分解、饲料发酵等大都是在缺氧环境或少氧环境下进行的,所以研究纤维素降解细菌在纤维素酶的生产中有重要作用[12-16]。

3.1 纤维素降解细菌分类
纤维素降解细菌主要分3大类:①厌氧纤维素降解细菌。主要包括中温性细菌、嗜热厌氧细菌、瘤胃纤维素降解细菌。嗜热厌氧纤维素降解细菌包括两种:一种是属于Clostridium属和Thermoanaerobacter属的能形成芽孢的中度嗜热菌,包括热纤梭菌、嗜热堆肥梭菌、产黄纤维素梭菌、月素氏梭菌、嗜热溶纸梭菌(C.thermopapyrolyticum)、嗜纤维梭菌、热粪生热厌氧杆菌即热粪生梭菌;另一种是属于热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor),包括解糖热解纤维素菌、产乳酸乙酸热解纤维素菌、克氏热解纤维素梭菌。②好氧性纤维素降解细菌。主要包括食纤维菌属、生孢食纤维菌属、粘细菌类中的粘球菌属、堆囊粘菌属。③嗜碱性纤维素降解细菌。主要是芽孢杆菌(Bacillus)的一些菌株。芽孢杆菌科的细菌中,能产纤维素酶的以芽孢杆菌属的细菌最多,梭状芽孢杆菌属的4个群中,仅群二的少数细菌产纤维素酶。从分离鉴定的结果来看,也是如此。因此,芽孢杆菌属的细菌在纤维素酶的应用方面更具代表性和可行性。
3.2 产纤维素酶菌株的筛选
在很多平板降解圈直接分离法分离CMCase菌株的方法中,以刚果红法为最好。其它的方法有的受底物来源的限制,有的灵敏度低需培养较长时间,有的则因杀死菌体而需用影印移植,这就造成很多不便。而采用刚果红法则无上述缺点,刚果红对菌体无任何不良的影响,产生的透明圈清晰,非常容易辨认,特别是它的高灵敏度,只要菌落长到用肉眼可见,就可产生清晰的透明圈。刚果红法除可用于识别产纤维素酶的菌株,还可用于初步判定酶活性高低。
3.3 纤维素酶活力的测定
关于纤维素酶活力的测定方法很多,至今也没有统一定论,而且用不同方法测定,结果也存在一定差异。Teather等认为,对数酶浓度同刚果红染色水解圈存在线形关系[16],产酶越多,透明圈越大;产酶越快,透明圈出现越早。因此本试验采用刚果红法。
然而,虽然透明圈大小直接反映了酶浓度的高低,但不能完全代表菌株产酶能力。试验表明,液体样品的酶浓度与透明圈的直径成线性关系,可以对酶活进行初步定量,但不能作为菌株产酶活力大小的唯一定量指标。因为刚果红纤维素平板筛选法受菌苔大小、菌苔在平板上的堆积情况、菌落之间相互位置和产物或分泌物的相互抑制、不同菌株生长和产酶速度、不同细菌细胞壁的特性等因素的影响,并不能精确反应纤维素酶活力的大小。但是这种方法在菌种的初步筛选上明显优于传统的方法,而且可以初步反映出产酶活力的高低。产酶能力越高,水解圈越大;产酶速度越快,水解圈出现的越早。这对于从大量菌种中初步筛选出纤维素高产菌株,不仅减少了工作量和盲目性,而且结果可靠。如果要进一步筛选出高产菌株,必须依靠液体发酵复筛。
3.4 结论
从牛粪中分离出35株兼性厌氧的芽孢杆菌,初步筛选出10株纤维素酶高产菌株,其中1株为梭菌属细菌,其余9株为芽孢杆菌属细菌。
参考文献
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(编辑:高 雁,snowyan78@tom.com


吴敏峰,四川农业大学动物科技学院,625014,四川雅安。
耿秀蓉,四川省中医药研究院中医研究所。
祝小、潘康成(通讯作者),单位及通讯地址同第一作者。