一株凝结芽孢杆菌的分离筛选及生物学特性研究
摘 要 研究采用改良MRS培养基，从土壤中分离一株能抑制常见病原菌的产酸芽孢杆菌。该菌株对大肠杆菌（Escherichia coli O139、E.coli K88、E.coli K99）、伤寒沙门氏菌[Salmonella typhimurium O4Hi（ST O4Hi）]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等均有较强的抑制作用，经生理生化试验和16S rDNA序列分析鉴定为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）。该菌株模拟胃液处理30 min后存活率为91％，耐胆盐浓度达3.0％，小鼠急性毒性试验结论为无毒无害物质。研究结果表明，该菌株可以顺利通过胃酸进入小肠后开始作用，改善肠道微生态环境，具有作为微生态制剂菌株的应用潜力。
关键词 凝结芽孢杆菌；分离；益生菌
中图分类号 Q93-3
乳酸细菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌的通称。在土壤、植物根际和许多的人类食品、动物的饲料，还有自然界的湖泊和河水、污泥以及一些临床样品中都发现有乳酸细菌的存在。
由于耐药性问题，抗生素在饲料中应用受到严格的限制，动物微生态制剂被认为是取代抗生素最具潜力的发展方向。目前常用的益生菌主要有乳酸菌、芽孢杆菌等。乳酸菌作为益生菌株应用于畜禽养殖已经有多年的历史，通常使用的菌株主要是粪肠球菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌等，这些菌株抗逆性较差，不耐热，在饲料加工过程中损失较大，不能象芽孢杆菌那样直接加到配合饲料中。因此产乳酸的芽孢杆菌已成为近年来乳酸菌研究的热点，其主要包括芽孢乳酸杆菌属和芽孢杆菌属的一些种。
凝结芽孢杆菌是乳酸菌的一种,它除了具有乳酸菌的所有特点外，还有抗逆性强、耐高温、易储存等芽孢杆菌所有的独特性。早在1989年,美国FDA公布的41种可用于饲料的安全菌株以及1992年再次批准42种中包括的5种芽孢杆菌中，凝结芽孢杆菌排在第一位。
本试验采用Kitahara等所报道的方法，采用改良MRS培养基从植物根部土壤中分离凝结芽孢杆菌，并从中筛选具有抑菌性好、抗逆性强的菌株，探讨其作为益生菌株的可能性。
1 材料和方法
1.1 菌株
指示菌株:SA、E.coli O139、E.coli K88、E.coli K99和ST O4Hi由农业部微生物学国家重点实验室动物病毒室提供。
1.2 培养基及溶液
MRS培养基：胰蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、柠檬酸二铵2 g、乙酸钠5 g、酵母粉5 g、葡萄糖5 g、磷酸二氢钾2 g、吐温80 1.0 ml、碳酸钙20 g、硫酸镁 0.58 g、硫酸锰0.25 g、水1 000 ml，调pH值6.2～6.5，115 ℃灭菌20 min。
改良MRS培养基：在MRS培养基基础上添加α－甲基葡萄糖苷10 g、山梨酸钾1 g，调pH值6.2~6.5， 115 ℃灭菌20 min。
凝结芽孢杆菌增殖培养基（YPD培养基）：葡萄糖20 g、胰蛋白胨20 g、酵母粉10 g、水1 000 ml，调pH值7.0，115 ℃灭菌20 min。
模拟胃液：胰蛋白胨8.3 g、葡萄糖3.5 g、氯化钠2.05 g、氯化钙0.11 g、氯化钾0.37 g、磷酸二氢钾0.6 g、猪胆盐0.05 g、溶菌酶0.1 g、胃蛋白酶13.3 g，蒸馏水1 000 ml，盐酸调pH值至1.5、2.5，115 ℃灭菌20 min。
固体培养基：在液体培养基的基础上添加1.5％的琼脂。
1.3 样品采集、菌株分离及筛选
分离样品采集于华中农业大学校园内多处植物根部土壤。
① 取采集样品10 g，放入装有90 ml无菌水并有小玻璃珠的250 ml三角瓶中，振荡20 min，静置20～30 s。
② 吸取10 ml上清液转接到改良MRS培养基中,37 ℃静置培养7 d。
③ 每个样品取2 ml，80 ℃水浴5 min，后取0.1 ml转接乳酸菌增殖培养基固体平板，37 ℃培养。
④ 待菌落长出,随机挑取菌落,纯化,编号并保存。
⑤ 活化好的菌液1 μl接种YPD平板中间,37 ℃培养,待其长出菌落后,倒入混有肠道致病菌的软琼脂,37 ℃培养,观察生长情况，挑选抑菌能力最强的菌株。
1.4 筛选菌株的鉴定
1.4.1 生理生化鉴定
参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行。
1.4.2 16S rDNA序列测定
用SDS碱裂解法提取细菌的总DNA，设计PCR引物分别为，P0：5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG -3'，PC3：5'-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3'。PCR程序为：95 ℃，5 min；94 ℃，1 min；50 ℃，1 min；72 ℃，1 min,30个循环后72 ℃延伸8 min。PCR产物回收纯化并测序，将所测得的序列与Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的16S rDNA序列进行Blastn分析比较。以16S rDNA基因序列同源性A>99%为鉴定标准。
1.5 凝结芽孢杆菌特性测定
1.5.1 耐模拟胃液试验
菌种活化后取1％接种量转接100 ml液体MRS培养基，37 ℃、200 r/min培养至全部形成芽孢后,离心去上清液,收集芽孢加入无菌合成胃液，0、30、180 min后分别用活菌平板计数法检测活菌数量。
1.5.2 耐胆盐试验
准备MRS液体培养基，其中分别加有0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%胆盐。取1 ml，37 ℃培养过夜后的菌体发酵培养液，加入9 ml以上胆盐浓度的培养液中。37 ℃静置培养12 h后，稀释10 000倍后取0.1 ml涂MRS固体琼脂平板。生长情况表明其能耐该浓度胆盐的能力。
1.5.3 耐抗生素试验
活化好的菌液0.1 ml接种MRS平板上，放入常用抗生素药敏纸片37 ℃培养，观察其生长情况。
1.5.4 急性毒性试验
安全性评价采用急性毒性试验，参照GB 15193.3—2003最大耐受剂量法进行。取体重在18～22 g的昆明小鼠雌雄各15只，观察3 d后，1日内分3次经口给予0.25 g/ml注菌液0.4 ml（相当于每千克体重15 000 mg），连续14 d观察小鼠是否有中毒和死亡现象。
2 结果与分析
2.1 初步分离及筛选结果
随机挑取菌落38个,划线分离纯化后编号F1～38,进行体外拮抗试验。试验结果表明，7株菌对5种指示菌有不同程度的抑制,其中F5菌株对肠道致病菌抑制能力最强，选取该菌株进行下一步的研究。
2.2 分离菌株的鉴定
2.2.1 形态学特征
菌株F5在YPD培养基上生长良好，48 h形成直径2~3 mm大小的圆形菌落，白色而有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐。油镜观察，菌株F5菌体形态为杆状，单个、成对或链状排列，芽胞端生。
2.2.2 生理生化特征（见表1）
将上述鉴定结果与《伯杰细菌鉴定手册》上关于芽胞杆菌属的描述相对照，菌株F5属于芽胞杆菌属（Bacillus sp.）。
2.2.3 16S rDNA基因的PCR扩增及序列分析
以P0和PC3为引物,菌株F5总DNA为模板进行PCR扩增。优化缓冲体系、镁离子浓度和模板DNA的稀释倍数，可以扩增出约700 bp的特异条带。从琼脂糖凝胶上切割特异性的700 bp的条带,试剂盒回收纯化PCR产物,送辽宁宝生物工程(大连)有限公司进行DNA序列的测定。将所测得的序列与Genbank中的16S rDNA序列进行Blastn相似性分析比较。菌株F5与Bacillus coagulans的16S rDNA序列的同源性达到了99％,在全长746 bp的序列中,只有1 bp的差异。
综合生理生化鉴定和16S rRNA测序的结果,可以认为菌株F5为凝结芽胞杆菌(B.coagulans)的1个亚种。
2.3 凝结芽孢杆菌F5的特性
2.3.1 耐模拟胃液能力（见表2）
由于凝结芽孢杆菌以芽孢的形式添加到动物饲料中，经过胃液时菌体应是芽孢状态，因此耐模拟胃液以芽孢为试验对象。通常猪的胃酸pH值在2.0~3.0，在刚进食后由于食物中和pH值可达到5.0以上，流体食物在胃中停留时间为1~2 h。实试结果表明，该菌株可耐受pH值2.5和pH值1.5合成胃液180 min，模拟胃液处理30 min后成活率为91％。
2.3.2 耐胆盐能力（见表3）
芽孢通过胃酸环境进入小肠后开始萌发，长成菌体，小肠中胆盐对菌体会有抑制作用，因此耐胆盐能力采用菌体作为试验对象。具体试验结果如表3所示，凝结芽孢杆菌最高耐受胆盐浓度为3.0％。猪小肠内胆盐浓度一般在0.03%~0.3%的范围，该菌株能顺利在小肠环境中发挥作用。
2.3.3 耐抗生素能力（见表4）
研究结果表明，磺胺、杆菌肽对凝结芽孢杆菌作用较弱，使用时可与其中一种或两者同时使用，其它一些常用抗生素对其抑制效果明显，使用时不能一起使用。
2.3.4 急性毒性试验
在急性毒性试验中，所有小鼠均未出现中毒和死亡现象。说明凝结芽孢杆菌F5急性毒性试验最大耐受剂量MTD>15 000 mg/kg，根据分级标准，该菌株为无毒物质。
3 结论
本试验首先通过改良MRS培养基筛选出产酸芽孢杆菌，将筛选出的芽孢杆菌进行抑菌试验，得到一株抑菌效果好的菌株，参照《伯杰细菌鉴定手册》进行一系列的生理生化实验，最后通过16S rDNA同源性为基础的系统学分析验证了此菌株为凝结芽孢杆菌。
凝结芽孢杆菌作为新型的益生菌正在被开发和使用。本文详细探讨了此株凝结芽孢杆菌F5作为益生菌应用的可能性。此株凝结芽孢杆菌F5生长较慢，可以以芽孢形式顺利通过胃酸环境，进入到肠道中生长定植。小肠的胆盐环境对此菌株没有抑制作用。现阶段对动物微生态制剂的研究希望其能取代抗生素应用。体外抑菌试验表明，凝结芽孢杆菌F5对大肠杆菌(Escherichia coli O139、E.coli K88、E.coli K99)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium O4Hi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有较强的抑制作用，可在肠道中替代抗生素抑制有害菌的生长，对调整肠道微生态环境有很好的效果。
参考文献
[1] 郭兴华．益生菌基础与应用[M]．北京：北京科学技术出版社,2002.
[2] Stephanie Doors，Dennis Westhoff：Journal of Food Scinece 1981, 46：810-812.
[3] R. E.布坎南. 伯杰细菌鉴定手册（第九版）[M].北京：科学出版社， 1995:744-745.
[4] 东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001:62-65.
[5] Sambrook J, Russell D W. Molecular cloning:a laboratory manual 3rd ed [M]. 3rd edition New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001:27-30.
[6] Pedersen C， Jonsson H， Lindberg J E， et al． Microbiological characterization of wet wheat distillers'grain with focus on isolation of lactobacilli with potential as probiotics[J]. Appl Environ Microbiol., 2004,70(3):1 522-1 527.
[7] Casey P G, Casey G D, Gardiner G E, et al. Isolation and characterization of anti－Salmonella lactic acid bacteria from the porcine gastrointestinal tract[J]. Lett.Appl. Microbiol.,2004,39:431-438.
[8] 季奎文,吕学敏．新型动物益生素凝结芽孢杆菌开发与应用[J]. 天津科技，2005（4）：50-51.
（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）
戴青，华中农业大学生命科学技术学院农业部微生物学国家重点实验室，430070，武汉。
赵述淼、谢树贵、梁运祥(通讯作者)，单位及通讯地址同第一作者。
关键词 凝结芽孢杆菌；分离；益生菌
中图分类号 Q93-3
乳酸细菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌的通称。在土壤、植物根际和许多的人类食品、动物的饲料，还有自然界的湖泊和河水、污泥以及一些临床样品中都发现有乳酸细菌的存在。
由于耐药性问题，抗生素在饲料中应用受到严格的限制，动物微生态制剂被认为是取代抗生素最具潜力的发展方向。目前常用的益生菌主要有乳酸菌、芽孢杆菌等。乳酸菌作为益生菌株应用于畜禽养殖已经有多年的历史，通常使用的菌株主要是粪肠球菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌等，这些菌株抗逆性较差，不耐热，在饲料加工过程中损失较大，不能象芽孢杆菌那样直接加到配合饲料中。因此产乳酸的芽孢杆菌已成为近年来乳酸菌研究的热点，其主要包括芽孢乳酸杆菌属和芽孢杆菌属的一些种。
凝结芽孢杆菌是乳酸菌的一种,它除了具有乳酸菌的所有特点外，还有抗逆性强、耐高温、易储存等芽孢杆菌所有的独特性。早在1989年,美国FDA公布的41种可用于饲料的安全菌株以及1992年再次批准42种中包括的5种芽孢杆菌中，凝结芽孢杆菌排在第一位。
本试验采用Kitahara等所报道的方法，采用改良MRS培养基从植物根部土壤中分离凝结芽孢杆菌，并从中筛选具有抑菌性好、抗逆性强的菌株，探讨其作为益生菌株的可能性。
1 材料和方法
1.1 菌株
指示菌株:SA、E.coli O139、E.coli K88、E.coli K99和ST O4Hi由农业部微生物学国家重点实验室动物病毒室提供。
1.2 培养基及溶液
MRS培养基：胰蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、柠檬酸二铵2 g、乙酸钠5 g、酵母粉5 g、葡萄糖5 g、磷酸二氢钾2 g、吐温80 1.0 ml、碳酸钙20 g、硫酸镁 0.58 g、硫酸锰0.25 g、水1 000 ml，调pH值6.2～6.5，115 ℃灭菌20 min。
改良MRS培养基：在MRS培养基基础上添加α－甲基葡萄糖苷10 g、山梨酸钾1 g，调pH值6.2~6.5， 115 ℃灭菌20 min。
凝结芽孢杆菌增殖培养基（YPD培养基）：葡萄糖20 g、胰蛋白胨20 g、酵母粉10 g、水1 000 ml，调pH值7.0，115 ℃灭菌20 min。
模拟胃液：胰蛋白胨8.3 g、葡萄糖3.5 g、氯化钠2.05 g、氯化钙0.11 g、氯化钾0.37 g、磷酸二氢钾0.6 g、猪胆盐0.05 g、溶菌酶0.1 g、胃蛋白酶13.3 g，蒸馏水1 000 ml，盐酸调pH值至1.5、2.5，115 ℃灭菌20 min。
固体培养基：在液体培养基的基础上添加1.5％的琼脂。
1.3 样品采集、菌株分离及筛选
分离样品采集于华中农业大学校园内多处植物根部土壤。
① 取采集样品10 g，放入装有90 ml无菌水并有小玻璃珠的250 ml三角瓶中，振荡20 min，静置20～30 s。
② 吸取10 ml上清液转接到改良MRS培养基中,37 ℃静置培养7 d。
③ 每个样品取2 ml，80 ℃水浴5 min，后取0.1 ml转接乳酸菌增殖培养基固体平板，37 ℃培养。
④ 待菌落长出,随机挑取菌落,纯化,编号并保存。
⑤ 活化好的菌液1 μl接种YPD平板中间,37 ℃培养,待其长出菌落后,倒入混有肠道致病菌的软琼脂,37 ℃培养,观察生长情况，挑选抑菌能力最强的菌株。
1.4 筛选菌株的鉴定
1.4.1 生理生化鉴定
参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行。
1.4.2 16S rDNA序列测定
用SDS碱裂解法提取细菌的总DNA，设计PCR引物分别为，P0：5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG -3'，PC3：5'-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3'。PCR程序为：95 ℃，5 min；94 ℃，1 min；50 ℃，1 min；72 ℃，1 min,30个循环后72 ℃延伸8 min。PCR产物回收纯化并测序，将所测得的序列与Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的16S rDNA序列进行Blastn分析比较。以16S rDNA基因序列同源性A>99%为鉴定标准。
1.5 凝结芽孢杆菌特性测定
1.5.1 耐模拟胃液试验
菌种活化后取1％接种量转接100 ml液体MRS培养基，37 ℃、200 r/min培养至全部形成芽孢后,离心去上清液,收集芽孢加入无菌合成胃液，0、30、180 min后分别用活菌平板计数法检测活菌数量。
1.5.2 耐胆盐试验
准备MRS液体培养基，其中分别加有0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%胆盐。取1 ml，37 ℃培养过夜后的菌体发酵培养液，加入9 ml以上胆盐浓度的培养液中。37 ℃静置培养12 h后，稀释10 000倍后取0.1 ml涂MRS固体琼脂平板。生长情况表明其能耐该浓度胆盐的能力。
1.5.3 耐抗生素试验
活化好的菌液0.1 ml接种MRS平板上，放入常用抗生素药敏纸片37 ℃培养，观察其生长情况。
1.5.4 急性毒性试验
安全性评价采用急性毒性试验，参照GB 15193.3—2003最大耐受剂量法进行。取体重在18～22 g的昆明小鼠雌雄各15只，观察3 d后，1日内分3次经口给予0.25 g/ml注菌液0.4 ml（相当于每千克体重15 000 mg），连续14 d观察小鼠是否有中毒和死亡现象。
2 结果与分析
2.1 初步分离及筛选结果
随机挑取菌落38个,划线分离纯化后编号F1～38,进行体外拮抗试验。试验结果表明，7株菌对5种指示菌有不同程度的抑制,其中F5菌株对肠道致病菌抑制能力最强，选取该菌株进行下一步的研究。
2.2 分离菌株的鉴定
2.2.1 形态学特征
菌株F5在YPD培养基上生长良好，48 h形成直径2~3 mm大小的圆形菌落，白色而有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐。油镜观察，菌株F5菌体形态为杆状，单个、成对或链状排列，芽胞端生。
2.2.2 生理生化特征（见表1）
将上述鉴定结果与《伯杰细菌鉴定手册》上关于芽胞杆菌属的描述相对照，菌株F5属于芽胞杆菌属（Bacillus sp.）。
2.2.3 16S rDNA基因的PCR扩增及序列分析
以P0和PC3为引物,菌株F5总DNA为模板进行PCR扩增。优化缓冲体系、镁离子浓度和模板DNA的稀释倍数，可以扩增出约700 bp的特异条带。从琼脂糖凝胶上切割特异性的700 bp的条带,试剂盒回收纯化PCR产物,送辽宁宝生物工程(大连)有限公司进行DNA序列的测定。将所测得的序列与Genbank中的16S rDNA序列进行Blastn相似性分析比较。菌株F5与Bacillus coagulans的16S rDNA序列的同源性达到了99％,在全长746 bp的序列中,只有1 bp的差异。
综合生理生化鉴定和16S rRNA测序的结果,可以认为菌株F5为凝结芽胞杆菌(B.coagulans)的1个亚种。
2.3 凝结芽孢杆菌F5的特性
2.3.1 耐模拟胃液能力（见表2）
由于凝结芽孢杆菌以芽孢的形式添加到动物饲料中，经过胃液时菌体应是芽孢状态，因此耐模拟胃液以芽孢为试验对象。通常猪的胃酸pH值在2.0~3.0，在刚进食后由于食物中和pH值可达到5.0以上，流体食物在胃中停留时间为1~2 h。实试结果表明，该菌株可耐受pH值2.5和pH值1.5合成胃液180 min，模拟胃液处理30 min后成活率为91％。
2.3.2 耐胆盐能力（见表3）
芽孢通过胃酸环境进入小肠后开始萌发，长成菌体，小肠中胆盐对菌体会有抑制作用，因此耐胆盐能力采用菌体作为试验对象。具体试验结果如表3所示，凝结芽孢杆菌最高耐受胆盐浓度为3.0％。猪小肠内胆盐浓度一般在0.03%~0.3%的范围，该菌株能顺利在小肠环境中发挥作用。
2.3.3 耐抗生素能力（见表4）
研究结果表明，磺胺、杆菌肽对凝结芽孢杆菌作用较弱，使用时可与其中一种或两者同时使用，其它一些常用抗生素对其抑制效果明显，使用时不能一起使用。
2.3.4 急性毒性试验
在急性毒性试验中，所有小鼠均未出现中毒和死亡现象。说明凝结芽孢杆菌F5急性毒性试验最大耐受剂量MTD>15 000 mg/kg，根据分级标准，该菌株为无毒物质。
3 结论
本试验首先通过改良MRS培养基筛选出产酸芽孢杆菌，将筛选出的芽孢杆菌进行抑菌试验，得到一株抑菌效果好的菌株，参照《伯杰细菌鉴定手册》进行一系列的生理生化实验，最后通过16S rDNA同源性为基础的系统学分析验证了此菌株为凝结芽孢杆菌。
凝结芽孢杆菌作为新型的益生菌正在被开发和使用。本文详细探讨了此株凝结芽孢杆菌F5作为益生菌应用的可能性。此株凝结芽孢杆菌F5生长较慢，可以以芽孢形式顺利通过胃酸环境，进入到肠道中生长定植。小肠的胆盐环境对此菌株没有抑制作用。现阶段对动物微生态制剂的研究希望其能取代抗生素应用。体外抑菌试验表明，凝结芽孢杆菌F5对大肠杆菌(Escherichia coli O139、E.coli K88、E.coli K99)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium O4Hi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有较强的抑制作用，可在肠道中替代抗生素抑制有害菌的生长，对调整肠道微生态环境有很好的效果。
参考文献
[1] 郭兴华．益生菌基础与应用[M]．北京：北京科学技术出版社,2002.
[2] Stephanie Doors，Dennis Westhoff：Journal of Food Scinece 1981, 46：810-812.
[3] R. E.布坎南. 伯杰细菌鉴定手册（第九版）[M].北京：科学出版社， 1995:744-745.
[4] 东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001:62-65.
[5] Sambrook J, Russell D W. Molecular cloning:a laboratory manual 3rd ed [M]. 3rd edition New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001:27-30.
[6] Pedersen C， Jonsson H， Lindberg J E， et al． Microbiological characterization of wet wheat distillers'grain with focus on isolation of lactobacilli with potential as probiotics[J]. Appl Environ Microbiol., 2004,70(3):1 522-1 527.
[7] Casey P G, Casey G D, Gardiner G E, et al. Isolation and characterization of anti－Salmonella lactic acid bacteria from the porcine gastrointestinal tract[J]. Lett.Appl. Microbiol.,2004,39:431-438.
[8] 季奎文,吕学敏．新型动物益生素凝结芽孢杆菌开发与应用[J]. 天津科技，2005（4）：50-51.
（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）
戴青，华中农业大学生命科学技术学院农业部微生物学国家重点实验室，430070，武汉。
赵述淼、谢树贵、梁运祥(通讯作者)，单位及通讯地址同第一作者。
