鼠李糖乳杆菌的功能特性研究

1前言

20世纪40 年代至今，抗生素一直是人类抵御细菌感染的最主要手段。但是使用抗生素能够引起细菌的抗药性，从而失去对这种细菌的抑制作用，如果使用不当还会对机体产生副作用。于是，人们开始不断寻找新的抗菌方法，并将目光转向了利用益生菌来抵御有害菌对人体的侵染和破坏。随着对乳酸菌研究的不断深入，各种运用活性乳酸菌的药物或食品相继问世，菌种大多数定位在双歧杆菌和以酸奶菌种———嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌为代表的益生菌。由于双歧杆菌是严格的厌氧菌，其生产和应用受到了极大的限制，而酸奶菌种缺乏在人体肠道的定植能力，为过路菌，其调节微生态平衡的能力较为薄弱。因此，开发耐酸、耐氧、定植力强、生产粗放的新型益生菌具有重要的意义。

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)， 从属于乳杆菌，它有调节微生态平衡，增强宿主肠道抵抗力，预防和治疗腹泻，消除过敏的功能，若干动物和人体试验显示该菌有一定的抑菌效果和加强免疫系统的功效，保证健康的肠道菌群。该菌株的人体摄入安全性可由若干体外和动物临床研究所保证。它可用于各种食品，保健食品和微生态制品或药品。

鼠李糖乳杆菌LGG (Lactobacillus rhamnosus GG)是最著名的鼠李糖乳杆菌， 属于乳杆菌属、鼠李糖乳杆菌种，革兰阳性菌，无质粒；不能利用乳糖，但可代谢单糖。上世纪80年代，由两位美国科学家Gorbach和Goldin从健康人的肠道中分离而得,并命名为鼠李糖乳杆菌LGG (Lactobacillus rhamnosus GG)。近年来，国外的科学家通过大量的动物实验和人体临床实验证明LGG能够耐受动物消化道环境，并能够在人和动物肠道内定植，起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿和提高机体免疫力等作用。目前，已经有大量的含鼠李糖乳杆菌LGG的益生菌制剂和食品进入各国市场，并受到广大消费者的青睐。

1.1鼠李糖乳杆菌的功能特性

1.1.1在人类肠道中的存活和定植

益生菌只有黏附于宿主的肠上皮细胞，进而定植、繁殖，才能发挥其维护微生态系群落结构及功能平衡，保护生物屏障作用，否则只能是过路菌，不能长期在肠道内存在，也就无法持续的对宿主机体产生益生作用。

对于鼠李糖乳杆菌在人体内的黏附和定植能力，人们也做了大量的研究。Alander等通过让志愿者连续服用以LGG发酵的乳清饮料12d，检查受试者活体肠道内容物和粪便样品，并对其中的菌落进行形态学检验、乳糖发酵实验和PCR检测，结果显示，样品中都含有LGG菌株，证实了 LGG能够在活体肠道内定植并存活^[1]。

1998年，Kaila Minna等在治疗轮状病毒引起的5～28月大的婴幼儿腹泻时，给29名患婴分别口服含LGG的制剂和普通牛乳，结果在服用LGG婴儿的粪便中检出LGG菌株，说明即便是在宿主患急性胃肠炎期间，LGG仍能够促进肠道菌群的平衡^[2]。其它的实验也证实了LGG能够抵御消化道环境的不利影响并在人体的肠道内定植。

在Pirkka等人进行的实验中测定了不同益生菌对人体肠黏膜的结合能力，结果发现，LGG无论对于成年人还是婴儿，均有较高的黏着率；其中，对成人黏膜的黏着率均高于婴儿黏膜的黏着率^[3]。这可能是由于婴儿肠道环境不成熟，可以提供的黏着位点较少的原因。

1.1.2提高机体免疫力

人体的免疫系统分为先天和适应性免疫系统，前者包括巨噬细胞、白细胞和自然杀伤细胞等，是机体的“第一道防线”；当有先天免疫系统无法识别入侵的微生物时，适应性免疫系统开始发生作用。二者共同构成了人体的免疫屏障。当宿主发生创伤、感染或变态反应时，机体的免疫系统会引发急性或慢性炎症，严重时会威胁生命^[4]。

食物中一些治病性的革兰阴性菌分泌的脂多糖会诱导机体产生非特异性免疫，并释放出前炎症细胞因子(Proinflammatory cytokines)，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)以及白细胞介素-10(IL-10)等。

大量实验表明，乳酸菌及其细胞壁成分能够促进人体外周血单个核细胞分泌和，TNF-α、IL-6 和IL-10，激活人体的免疫系统。Miettinen等在实验中发现，通过LGG等乳酸菌与血液中细胞因子的反应，能够抑制食物中革兰阴性致病菌引起的免疫功能失调，并能诱导产生较多的TNF-α、IL-6 和IL-10^[5]。

Jeremy等报道了LGG能够调节TNF-α等细胞因子的分泌。其进行的鼠肠道微生物菌群体外实验结果显示，LGG能够防止巨噬细胞分泌过量的TNF-α，起到预防和治疗结肠炎的作用。但未发现对IL-10有明显影响^[6]。

其它大量的临床实验和体外实验也证实了LGG具有在炎症初期激发机体自身非特异性免疫应答的功效，有效的抵御外源性抗原对宿主机体的威胁，能够起到提高宿主自身免疫力的作用。

1.1.3减少或消除体内和食物中的毒素

在食品卫生的污染因素中，生物毒素对食品的污染是最重要的污染之一，而黄曲霉毒素则因其对人、畜肝脏的剧烈损害而名列毒性之首。黄曲霉毒素（Aflatoxins）是由某些存在于粮食和饲料上的真菌所产生的有毒代谢产物，是最常见的一类真菌毒素，它可引起家畜、动物和人类的多种疾病。有资料记载，黄曲霉毒素B₁的毒性在剧毒化学药品氰化钾的10倍以上。尽管经过几十年的研究，黄曲霉毒素的化学结构、性质、对人畜的损害机理已研究得比较透彻，世界各国也都对其在食品中的污染进行了严格的规定，并采取多种方法来消除黄曲霉毒素的危害，例如添加山梨酸、苯甲酸及其盐类等，但效果并不理想，且这些化学防霉剂可能对人和动物产生不良影响。于是，人们在不断研究物理分离、热灭活处理、辐射处理和溶剂提取等去毒方法的同时，考虑能否利用微生物来降低黄曲霉毒素的危害。

Carolyn等通过酶联免疫吸附实验证实LGG能够吸附黄曲霉毒素B₁。进一步的实验表明，在与人体内环境相似的条件下(4～37℃，pH2～10)，利用高压和超声波降解法都不能使黄曲霉毒素B₁从LGG菌体表面脱离^[7]。同年，Kankaanpaa和Tuomola等也报道了LGG在Caco-2模型中对黄曲霉毒素的吸附作用^[8]。

此外， El Nezami和Polychronaki等还报道LGG对玉米烯酮(一种由粉红镰刀菌产生的霉菌毒素)的吸附作用^[9]；Halttunen和Kankaanpaa的实验证实了LGG能够去除食物中的重金属镉^[10]。

此外，LGG对蘑菇毒素、贝类毒素等的预防和治疗也在人们越来越重视食品安全的今天，LGG在消除食源性毒素方面的特性必将会引起人们更多的关注。

1.1.4抑制肠道内有害菌的生长

大量的微生物存在于人体的肠道内，这些微生物共同构成了人体肠道的微生态环境。正常的肠道菌群微生态平衡应具有以下4 方面的特征：(1)不同微生物的正常菌群在空间所处的位置基本固定；(2)所存在的微生物的种属固定不变；(3)不同部位的各类微生物菌群和成员的数量基本固定，是微生态平衡的关键之一；(4)微生物和宿主的种属具有特异性，源自不同宿主的微生物可能会在其它宿主体内引起不良反应^[11]。

人体的微生态平衡受宿主的种类、年龄、应激反应、感染、疾病，以及食物、抗生素、辐射等外界因素的影响，会发生失衡。近年来，由食源性致病菌导致人体微生态失衡，引发疾病的事故呈上升趋势。

益生菌调节人体肠道菌群平衡的功效已被世人所认可。Apostolou等给9名健康志愿者和8名对牛乳敏感的患者服用LGG制剂，4星期后，发现牛乳敏感患者粪便中的肠道厌氧菌群与健康人的接近，同时，对牛乳敏感的症状基本消失；另外，健康组样本中的双歧杆菌数量显著提高。大量的实验结果表明，LGG具有调整体内菌群的功效，保持宿主肠道内微生态平衡。

Silva对LGG产生的抑菌物质进行了研究，结果表明，LGG在厌氧条件下对E.coli的抑制作用比在有氧条件下明显，而对其它的乳杆菌无抑制活性^[12]。

1.1.5预防和治疗腹泻

病毒、细菌、寄生虫及其产生的毒素引起肠黏膜炎症时会出现腹泻，另外，由于滥用抗生素也会引起腹泻。早在1990年，芬兰的Oksanen 和Salminen等就报道了LGG对腹泻的治疗作用。他们将820名旅游者分成两组并进行跟踪调查，分别服用LGG制剂和空白安慰剂。对比结果发现，LGG能够有效地预防腹泻的发生率，而且未发现有副作用^[13]。

同年，Siitonen和Salminen等报道了以LGG发酵的酸奶对由抗生素引起的腹泻的治疗作用。在不发达地区，营养不良是引起婴幼儿急性腹泻的主要原因之一。秘鲁的Oberhelman等也报道了LGG对秘鲁儿童急性腹泻具有明显的预防作用。204 名6～24月的营养不良的婴儿通过服用含的LGG制剂，可以缩短其腹泻的持续时间，并且粪便中的腺病毒大大减少。

大量的临床研究证实，LGG能够有效地治疗腹泻。特别对于经济欠发达地区，婴儿的母乳喂养率较低，新生儿和婴儿腹泻发病率较高，服用LGG制剂或LGG发酵食品，能够大大缓解这一症状。

1.1.6鼠李糖乳杆菌的其它生理功能

龋齿是儿童的常见病和多发病，而95%的蛀牙是由一种名为突变链球菌（Streptococcus Mutans）的细菌引起的。实验表明，对于1～6 岁的儿童，服用含LGG益生菌的乳制品7个月后，其牙垢和唾液中的突变链球菌总数显著降低，说明LGG具有预防龋齿的功效^[14]。

此外，LGG还具有其它许多对人体有益的生理功能，如能够治疗花粉过敏并加速过敏后的恢复、预防便秘、治疗急性肠炎等作用。

1.2 鼠李糖乳杆菌的安全性

通常认为天然存在的乳酸菌是安全无毒的，但随着越来越多新型的乳酸菌引入发酵食品和医药制剂，对其安全性进行检验就显得愈发重要。

Donohue等人以鼠作为研究对象，得出LGG 对鼠的半数致死剂量LD₅₀ >6，根据鼠与人之间口服LD₅₀ 之间的关系，推断对于一个体重为70kg的人，LGG的为420g冻干菌粉(10¹⁰～10¹¹ cfu/g)。而对于正常的发酵乳制品，其中乳酸菌数为10⁶～10⁹cfu/mL，对于150～500g酸奶，其中的乳酸菌数仅相当于1～2g冻干菌粉，远小于LD₅₀的420g，不会对人体造成危害^[15]。

能否引起血小板凝集也是评价益生菌安全性的重要指标之一。Korpela等人进行的实验证实了LGG不影响血小板的自发凝集，证明了LGG的安全性^[16]。众多研究结果都表明，鼠李糖乳杆菌及含鼠李糖乳杆菌的食品或药品具有极高的安全性，对机体并无任何不良影响，是一种安全无副作用的益生菌。

1.3鼠李糖乳杆菌在食品中的应用前景

乳酸是乳酸菌的主要发酵产物，可分为3种类型：L-乳酸、D-乳酸和DL-乳酸。由于人体内只有L-乳酸脱氢酶，因此只能够代谢：L-乳酸。WHO规定，每人摄入D-乳酸量不得超过100mg/kg ，而在3个月以下婴儿的食品中不得含有 D型和DL 型乳酸^[17]。鼠李糖乳杆菌LGG发酵过程中只产生L-乳酸，而不会产生对产品的安全性和口感有影响的其它酸类^[18]，因此含有LGG的发酵食品不会使人(尤其是婴幼儿) 产生不良反应，具有非常重要的价值。

同时由于鼠李糖乳杆菌能够耐受动物消化道环境，具有能够在人和动物肠道内定植，起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿和提高机体免疫力等功能特性，因此利用此益生菌具有广泛的应用前景。

目前在国际市场上销售的产品以发酵乳制品LGG为主，此外还有保鲜奶、干酪、婴儿食品、果汁、果汁饮料以及药品等，并得到了广大消费者和医疗工作者的认可。

鼠李糖乳杆菌的研究和应用始于20 世纪80年代，经过多年的研究，其对疾病的预防和治疗，以及提高机体免疫机能的作用已经得到各国科学工作者的广泛认同，并已经正式用于食品和临床药品的生产。1987年，芬兰维利奥公司获得了鼠李糖乳杆菌LGG的全球唯一授权。目前，在全球30 多个国家已有LGG产品生产和销售。我国对于LGG的研究和含产品的开发起步较晚，而且鲜有产品问世，还需广大从事功能性保健食品开发和药品研究的科研工作者进一步的努力。

本试验对一株新的鼠李糖乳杆菌LV108 （保藏号为CGMCC No.1531，中国专利申请号为：200510111588.9）发酵乳急性毒性、其抑菌作用、发酵性能、冷冻干燥性能等进行了深入研究，为开发新型功能性微生态调节剂提供技术依据。 

2材料与方法

2.1材料

2.1.1 试验材料

（1）试验用菌株

本研究所涉及的鼠李糖乳杆菌LV108由扬州大学乳品研究所从广西、新疆等地分离、保藏；

对照菌株BB-12菌株由CHR.Hansen公司提供；

致病性大肠杆菌O13由扬州大学医学院提供；

幽门螺旋杆菌11637购于中国疾病预防控制中心传染病预防控制所；

人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞购于中科院上海生化所；

DH5α感受态细胞由扬州大学畜牧兽医学院提供。

（2）试验用动物

种属和品系：ICR小鼠，雌雄各半，体重：20±2g；

来源：由南京江宁汤山青龙山实验动物中心提供；

合格证：SCXK（苏）2002-0018。

2.1.2主要试剂及培养基

2.1.2.1主要试剂

DMEM培养液：由78%DMEM，20%灭活（30min,56℃）小牛血清，1%青霉素、链霉素双抗溶液，1%谷氨酰胺组成。

PBS缓冲液（pH7.4）：由8g NaCl，0.20g KCl，1.14g Na₂HP0₄·7H₂O，0.24g KH₂PO₄加水定容至1000 mL配置而成。

维生素E ，SOD试剂盒，MDA试剂盒均购自南京聚力生物制品公司。

生化试剂购自上海生物工程公司。

实验中所用的随机引物由上海生物工程公司合成，序列由表2-1所列。

2.1.2.2 培养基

（1）脱脂乳培养基

成分：

脱脂乳粉         10g           酵母浸膏           0.1g

蒸馏水           100ml         115℃灭菌 15min。

（2）MRS 固体培养基

成分：

牛肉膏            10g         酵母浸膏            5g

蛋白胨            10g         无水醋酸钠          5g

碳酸钙            1g          吐温-80             1mL

K₂HPO₄             2g          琼脂               15-20g

盐液A            5mL         蒸馏水             1000mL

制法：（1）将各成分溶解于蒸馏水中，调 pH6.5，过滤，加入葡萄糖 20g。

（2）121℃灭菌 20min 后倾注平板备用。

注：盐液A：MgSO₄·7H₂O 11.5g,MnSO₄·4 H₂O 2.8g蒸馏水1000mL。

（3）PY 液体培养基

成分：

蛋白胨               0.5g        盐溶液              4.0mL

酵母浸粉             1.0g        蒸馏水              100mL

胰酶解酪朊（Trypticase BBL）      0.5g

制法：加热溶解，分装于小试管中，5mL/支，112℃灭菌 20min。

注：盐溶液：无水CaCl₂ 0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.48g、K₂HPO₄ 0.1g、KH₂PO₄ 1.0g、NaHCO₃10.0g、NaCl 2.0g。将无水CaCl₂和MgSO₄·7 H₂O混合溶解于300mL蒸馏水中，再加500mL蒸馏水，一边搅拌一边缓慢加入其它盐类。继续搅拌直到全部溶解，加200mL蒸馏水，混合后置于4℃保存备用。

（4）PYG培养基：PY基础培养基中加入1.0g葡萄糖即为PYG培养基。

（5）TPY 液体培养基

成分：

胰酶解酪朊（Trypticase BBL）  10g     CaCl₂            0.15g

植质蛋白胨（Phytone BBL）     5g     K₂HPO₄（3H₂O）  2g

吐温-80                      1ml      FeCl₃           微量

半胱氨酸-HCl                 10.5g     琼脂           15g

葡萄糖                       15g      蒸馏水         1000ml

制法：将除琼脂以外的其它成分加入水中加热溶解。调 pH6.5，再加入琼脂煮沸溶解，121℃灭菌 15min。

（6）营养肉汤培养基

成分：

牛肉膏                  2.5g       胰蛋白胨          5.0g

NaCl                    2.5 g      K₂HPO₄（3H₂O）   1.3g

蒸馏水500mL

制法：各组分于中加热溶解，调pH7.4，于121℃下灭菌15min备用。

（7）营养琼脂培养基

成分：

牛肉膏                  3.0g       蛋白胨            5.0g

琼脂                    15.0g      蒸馏水            1000mL

制法：将各组分加热溶解，于121℃下灭菌15min备用。

Skirrow氏培养基购于上海生物工程有限公司。API CHL培养基和API 50 CH试剂条购于法国生物梅里埃中国有限公司。

2.1.3 主要仪器设备

TGL－16 高速台式离心机            上海医疗器械六厂

TGL－168高速台式离心机           上海安亭科学仪器厂

手提灭菌锅                           上海医用核子仪器厂

pHS－3B精密pH计                   上海电磁仪器厂

电热恒温培养箱WS2－134－75         上海跃进医疗器械一厂

CO₂细胞培养箱WJ－3A            上海跃进医疗器械厂

格兰仕微波炉                       顺德格兰仕电器实业有限公司

PHILCO冰箱                        美国飞歌国际有限公司

HH－6型数显恒温水浴锅           国华电器有限公司

XW－80A旋涡混合器              上海琪特分析仪器有限公司

BS2000S型电子天平（1/100）       北京赛多利斯天平有限公司

BS210S型电子天平（1/10000）      北京赛多利斯天平有限公司

752型紫外分光光度计              上海分析仪器厂

501型离心机                      北京医用离心机厂产品

UV－VIS型紫外可见分光光度计     上海棱光技术有限公司

SW－CJ－1F型单人双面工作净化台  苏州净化设备有限公司

密封罐                            自制

2.2研究方法

2.2.1供试菌株的活化

2.2.1.1乳酸菌的活化

将已纯化冷冻保存或真空冻干燥保存的菌种，接种于脱脂乳培养基中，37℃、培养 24h，活化培养2-3代。将活性达到最佳的菌株接种到MRS或TPY液体培养基内，培养18-24h后，仔细观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征。测其OD₆₀₀值，以MRS液体作空白对照。当OD₆₀₀在0.5左右时，其活菌数达2×10⁸-10⁹cfu/ml。

2.2.1.2致病性大肠杆菌的活化

将大肠杆菌接种于营养肉汤中，37℃培养18h后，传2-3代。平板计数法计活菌数。控制其活菌数在10⁶cfu/ml，此浓度易致病。

2.2.1.3幽门螺旋杆菌的活化

将冻融后的幽门螺旋杆菌吸取少量于Skirrow氏培养基表面，稍推开后，置于密封罐中37℃培养，密封罐内创造微氧环境（85% N₂，10% CO₂ ，5% O₂），抽成真空，充填CO₂ 气体和N₂气体。

2.2.2 功能特性的研究

2.2.2.1鼠李糖乳杆菌LV108发酵乳急性毒性实验研究^{[19,20,21,22,23,24]}

给预实验，测出其LD50，如果无法测得，对其进行最大耐受量（MTD）实验。

给予小鼠最大浓度、最大灌胃容积（0.4ml/10g，2次/d）的鼠李糖乳杆菌发酵乳。给药后即对动物的精神状态、毛色、自主活动、呼吸、饮食、二便、口鼻分泌物等一般状况及死亡情况连续观察一周，对于死亡动物应立即解剖观察心、肝、脾、肺、肾等脏器，记录病变情况，如肉眼可见的病变，则需对其进行病理切片检查。

2.2.2.2耐酸和耐胆汁酸盐试验^{[25,26,27,28]}

选择本实验室保存的部分菌种，进行了耐酸和耐胆汁酸盐的试验，目的是筛选出既耐酸又耐一定胆汁酸盐浓度的菌种。

用混合酸将MRS培养基分别调节成pH2.0 MRS培养基、pH3.0 MRS培养基，在pH2.0 MRS培养基、pH3.0 MRS培养基中各加入0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的胆汁酸盐。以MRS培养基为空白对照。

在不同的培养基中，按2%的接种量接种供试菌的培养液，置37℃分别培养1h、2h、3h、4h、5h、6h、16h，以0h为对照，在波长600nm下测OD值。

2.2.2.3抑菌试验 

益生菌是一类活的微生物，其在代谢过程中会产生有机酸、细菌素、过氧化氢和类细菌素等物质。实验室或临床实践研究表明，这类物质可以抑制胃肠道中某些有害微生物如大肠杆菌、沙门氏菌、幽门螺旋杆菌等生长繁殖，对致病菌引起的肠道感染、腹泻等疾病有预防和保护作用。

本研究主要通过供试菌株对致病性大肠杆菌及幽门螺旋杆菌的双重抑制作用，来进一步筛选益生菌，了解其抑菌功效，为研制功能性益生菌制品提供参考。

2.2.2.3.1抑制致病性大肠杆菌试验^[29,30]

1）单层营养琼脂平板扩散法（AWDA法）

①抑菌性能观察

将营养琼脂培养基冷却到40℃左右时倾注到无菌培养皿中，待凝固后，吸取活化好的大肠杆菌菌液1mL在平板表面均匀涂开，37℃固定培养菌落30min，在平板上打3个ф4mm的孔，孔深3mm，将供试菌液注至满孔，不可溢出孔外，于37℃培养24h观察、测量抑菌圈直径；同时用对照菌株BB-12作对照。

②判定标准

抑菌圈直径4mm为不敏感；直径5～8mm低度敏感；8～12mm中度敏感；直径>12mm为高度敏感。

③数据处理

每株菌株做2组重复。

2）混合培养法

①混合

分别吸取乳酸菌菌液、大肠杆菌的菌液1mL于无菌试管中，加入MRS液体培养基4mL，37℃深层培养18h。

②计数

将混合培养液稀释，取10^－3、10^－4、10^－5、10^－6四个稀释度，用伊红美兰培养基计数其中大肠杆菌的活菌数。

2.2.2.3.2抑制幽门螺旋杆菌试验^[31]

①乳酸菌培养及菌数调整

将活性达到最佳的菌株接种到MRS液体培养基内，培养18h后，测其OD₆₀₀值，以MRS液体培养基作空白对照。当OD₆₀₀在0.5左右时，其活菌数达2×10⁸-10⁹cfu/mL。

②幽门螺旋杆菌菌落的洗脱和比浊

用生理盐水将培养皿表面的菌落洗脱下来，同麦氏标准比浊管进行比浊，确定菌数的浓度，使其浓度控制在10⁵cfu/mL。

③菌液涂沫、打孔及抑菌性能观察

吸取菌液0.5mL于培养基平板上，用无菌涂抹棒于超净工作台内通无菌空气，放置1h，待表面的菌液固定后打孔，孔直径4mm，孔深3mm，将供试菌液注至满孔，不可溢出，于37℃微需氧环境培养48h，观察结果、测量抑菌圈直径。同时用幽门螺旋杆菌对照菌株作对照。

④判定标准

抑菌圈直径4mm为不敏感；直径5～8mm低度敏感；8～12mm中度敏感；直径>12mm为高度敏感。

⑤数据处理

每株菌株做2组重复。

2.2.2.4 粘附能力试验^[32~40]

2.2.2.4.1菌悬液制备

①乳酸菌悬液制备

将乳酸菌接种于MRS肉汤培养基中，37 ℃，厌氧培养18-20h生长至最适后，取菌液离心获得耗尽培养上清，细菌浓度用耗尽培养上清稀释，调OD600＝0.5±0.05 ，此时浓度介于3×10⁸-10⁹个/mL之间，得到细菌悬液。

②大肠杆菌悬液制备

挑取大肠杆菌单个菌落,接种于5mL LB肉汤，37℃摇床培养过夜。以体积分数为2%的LB菌液接种于5mL新鲜的LB肉汤，37℃通气培养3小时。调浓度为10⁸cfu/mL。

2.2.2.4.2细胞培养

结肠腺癌系Caco-2细胞株，按常规传代培养于DMEM培养液中，37℃ 10% CO₂和90%空气中培养，每2天换一次培养液。

2.2.2.4.3 细菌粘附性试验

用于粘附实验的细胞需是1小时前刚换过培养液的细胞。将培养好的细胞制成细胞悬液（5×10⁴个/mL），向已放置盖玻片的24孔板中加入2mL细胞悬液，37℃ 10% CO₂和90% 空气中培养，待在盖玻片上形成单层细胞后，吸出旧的细胞培养液，经pH7.4无菌 PBS清洗2次后，每孔加入1mL供试菌悬液和1mL细胞培养液，37℃培养2小时。经pH7.4无菌PBS漂洗3次，甲醇固定，再经pH7.4无菌PBS漂洗3次，革蓝氏染色，高倍镜下分别选取单个细胞及多个细胞的视野，以细胞周围的菌为主计数30个细胞粘附的细菌数，计算平均数及标准差。

2.2.2.4.4 对大肠杆菌细胞粘附力的抑制试验

①先用乳酸菌进行粘附2小时，再用大肠杆菌粘附2小时，依上述步骤镜检，计数30个细胞粘附的大肠杆菌数。

②先用大肠杆菌进行粘附2小时，再用乳酸菌粘附2小时，依上述步骤镜检，计数30个细胞粘附的大肠杆菌数。

2.2.2.5抗氧化试验^[41~52]

为了研究益生菌发酵乳的功能特性，进行了产品抗氧化试验。

取体重18-22g的ICR品系小鼠，随机分为受试品A、K、Q、R和Hansen BB-12组，分别设立高、低两个剂量组，另设对照组和阳性对照组（维生素E 9mg/kg），共12个组，每组10只。按40mL·kg-¹ ·d^-1等容量不等浓度灌胃给予受试品和阳性对照品维生素E，连续给药8天。对照组同时灌胃生理盐水。末次给药后摘眼球取血，静置，分离血清。分别按黄嘌呤氧化酶法（试剂盒）测定血清中的SOD含量；按硫代巴比妥酸法（试剂盒）方法测定血清中的MDA。 

2.2.3鼠李糖乳杆菌LV108的加工特性研究

优良特性的乳酸菌菌种必须具有较好的稳定性及加工特性，主要包括：①保持活性能力稳定；②发酵产品具有良好的组织质地和风味；③贮藏期间维持酸度基本稳定；④加工及贮藏期间定植特性的保持；⑤发酵产品中优良贮藏稳定性；⑥冷冻干燥或其他干燥方法处理后具有稳定性；⑦正确的菌株鉴定；⑧有效剂量的实验数据^{[ 53]}。

本文重点研究了鼠李糖乳杆菌的发酵特性、鼠李糖乳杆菌的贮藏特性以及鼠李糖乳杆菌的冷冻和干燥能力。

2.2.3.1鼠李糖乳杆菌LV108的发酵特性

配制脱脂乳培养基，然后分装入250 mL的三角烧瓶中（100mL），经巴氏杀菌（62℃～65℃30min），冷却至43℃接种，鼠李糖乳杆菌LV108按3℅接种量接种，放入恒温箱中37℃培养。观察凝乳时间，每隔10h各取出2瓶进行酸度滴定和粘度测定，并测定鼠李糖乳杆菌活菌的数量。

2.2.3.2鼠李糖乳杆菌LV108的贮藏特性研究

将鼠李糖乳杆菌LV108发酵乳分别在4℃、15℃、25℃下恒温贮藏30天，研究鼠李糖乳杆菌活菌数量变化、酸度变化情况。

2.2.3.3鼠李糖乳杆菌LV108的干燥能力研究

2.2.3.3.1真空冷冻干燥

①收集菌体, 制备菌悬液　将扩大培养的菌种, 离心后在无菌操作台中迅速倾去上清液, 将细胞糊状物（菌泥）加入已灭菌的保护剂中（保护剂∶菌泥（体积比）= 3∶1）,振荡使其混合均匀, 备用。

②真空冷冻干燥　在无菌条件下,将菌悬液倒入已灭菌的真空冷冻干燥瓶, 用报纸包好瓶口以免杂菌污染。将干燥瓶转入低温冰柜中, 在-30 ℃左右预冻12h, 使其均匀冻结在瓶四周内壁上, 然后开启真空冷冻干燥机, 等温度降至-40℃～-50℃时, 打开真空泵, 抽真空度至5m Torr,装好干燥瓶,干燥12h～15h后,分别测定其活菌数。将干粉制品保藏在4℃冰箱中。

③测定方法 

活菌数测定　待试验菌株以培养基为计数培养基,采用梯度稀释平板计数法, 即在无菌操作条件下,将充分搅匀的检样吸取1mL,加入灭菌生理盐水,制成1：10的均匀稀释液;再依次进行10倍递增稀释,至适当稀释度。吸取1 mL置于灭菌培养皿中, 然后倒入约15mL水浴至50℃左右的琼脂计数培养基,摇匀。待其凝固后, 于40℃二氧化碳培养箱中倒置恒温培养 48h后, 进行菌落计数。

④存活率的计算 细胞存活率=（冻干后1g样品中测得的活菌数×粉剂重量）/（冻干前 1mL 样品中测得的活菌数×混悬液体积）×100%

1.2.3.3.2喷雾干燥

①芯材的制备　被微囊化的核心物质,称为芯材,其制备步骤如下:先将待试验菌株接种到10%的灭菌乳中, 42℃培养凝乳后转接, 活化两次, 按2%的接种量接种于20%的灭菌乳中, 42℃培养4～6h后凝乳。将凝乳的酸奶（300mL）离心（3000r/min,10min），去除上清液,用高速均质器进行混匀,即是芯材。

②壁材的制备　用作“包埋”的外层膜质, 即壁材。应具以下特性:能形成稳定的乳化液；能形成膜；无味无臭对人菌无毒；遇到水易释放。

③均质乳化　将上述芯材和壁材混合, 其中固形物大致为30%～50%,用高速均质器（24000 r/min,5min）均质使其充分乳化。

④喷雾干燥　根据芯材和壁材的乳化情况,选择适当的进口温度，一般为148～ 156℃, 出口温度为 68～71℃，喷雾干燥样品真空封口室温保存。

⑤活菌检测　干燥前活菌检测：从凝乳样品中取样, 用生理盐水10倍稀释至10^-5、10^-6、10^-7, 然后各取0.1mL涂布平板, 42℃48h培养后计数菌落数。

干燥后活菌检测：称取已喷雾干燥后的样品0.5g,用生理盐水定容至10mL, 再用生理盐水10倍稀释至10^-5、10^-6、10^-7,涂布于培养基平板中,42℃培养48h后计数。

将对照菌株BB-12和鼠李糖乳杆菌LV108发酵乳采用冷冻干燥和喷雾干燥，研究不同干燥方法下乳酸菌的存活率。

2.2.3.4冷冻干燥对菌种产酸粘附能力和抑菌特性的影响

鼠李糖乳杆菌LV108经过冷冻干燥后，经过3代活化后，比较其产酸能力、粘附能力和抑菌特性 

3结果与分析

3.1功能特性的研究

3.1.1鼠李糖乳杆菌LV108发酵乳急性毒性实验研究

经预实验，无法测出其LD50，故对其进行最大耐受量（MTD）实验。给予小鼠最大浓度、最大灌胃容积（0.4ml/10g，2次/d）的鼠李糖乳杆菌LV108发酵乳。给药剂量及动物死亡数见表。

表1  小鼠灌胃最大耐受量

由表1可见，小鼠对鼠李糖乳杆菌LV108发酵乳的最大耐受量为80 ml/kg。

给药后小鼠未出现不适症状，在整个观察期间精神状态良好、毛色光洁、活动自如、呼吸均匀、口鼻内无异常分泌物，动物饮食量正常，便软，小便无异常。观察一周后，称体重，周体重增长率为：31.3%。

 于第8天脱颈椎处死动物，并对所有动物进行尸检，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等内脏器官均未见任何异常。

3.1.2鼠李糖乳杆菌LV108耐酸和耐胆汁酸盐的研究       

鼠李糖乳杆菌LV108和BB-12在pH值分别为2和3时，在不同胆汁酸盐浓度下生长特性分别如图1～图4所示。

图1  鼠李糖乳杆菌LV108在pH2、不同浓度胆汁酸盐中生长情况

图2  BB-12在pH2、不同浓度胆汁酸盐中生长情况

图3  鼠李糖乳杆菌LV108在pH3、不同浓度胆汁酸盐中生长情况

图4  BB-12在pH3、不同浓度胆汁酸盐中生长情况

由图1～图4可以看出：（1）所试鼠李糖乳杆菌LV108和BB-12两个菌株均可以在pH2、0.3%胆汁酸盐中存活5h,在pH3中存活率高于pH2中的存活率。

（2）两个菌株在pH3中，OD值随着胆汁酸盐浓度的增加、培养时间的延长而增加，说明这两个细菌均具有生长能力。且两个菌株在pH3、0.2%胆汁酸中OD值随着培养时间的延长而增加，说明在这样的环境中它能够继续生长。

（3）鼠李糖乳杆菌LV108在相同pH值、不同胆汁酸盐浓度下，其耐受能力高于BB-12在pH2、0.4%的胆汁酸盐浓度下的耐受能力。

3.1.3抑制致病菌试验

3.1.3.1对大肠杆菌的抑制作用

3.1.3.1.1 AWDA法抑菌效果比较

①通过单层营养琼脂平板扩散法，观察孔内乳酸菌通过琼脂渗透向周围扩散生长的情况，发现孔洞周围有呈透明的抑菌圈出现，说明供试乳酸菌菌株对大肠杆菌有抑制作用，测量发现不同的菌株出现的抑菌圈大小不等，说明不同乳酸菌对大肠杆菌的的抑制能力亦不相同，结果如表2、图5～图6所示。

   表2  不同乳酸菌对大肠杆菌的抑菌能力的比较      单位：㎜

图5 鼠李糖乳杆菌LV108对E.Coli对的拮抗能力  图6  BB-12对E.Coli对的拮抗能力

从表1可看出鼠李糖乳杆菌LV108的抑菌圈直径达12.6㎜，与标准菌株BB-12相比高出4.1㎜，抑菌能力相对较强。

3.1.3.1.2混合培养法抑菌效果比较

大肠杆菌和乳酸菌菌液混合培养24h后，稀释计数其中的活菌数，结果发现在单扩实验中抑菌圈较大的菌株与大肠杆菌混合后，大肠杆菌活菌检出的较少；反之，抑菌能力稍差的菌株中的大肠杆菌活菌数较多。不同菌株与大肠杆菌混合抑制其能力比较如表3。

           表3 不同菌株与大肠杆菌混合后抑菌能力的比较      单位（CFU/mL）

Table 3 Comparison of inhibit effect from E.coli of different lactic acid bacteria mixed with E.coli

从表2可以看出，实验菌株与大肠杆菌混和培养24h后，大肠杆菌的菌数均有所下降，下降程度明显，说明都具有抑制大肠杆菌生长的能力。以BB-12抑制大肠杆菌的对照看来，鼠李糖乳杆菌LV108较强，活菌数仅为2.0×10³cfu/mL。

3.1.3.2对幽门螺旋杆菌的抑制作用

通过单层营养琼脂平板扩散法，每株菌株做2个平皿，每个平皿打3个孔，观察孔内乳酸菌通过琼脂渗透向周围扩散生长的情况，发现孔洞周围有呈深绿色的抑菌圈出现，说明供试乳酸菌菌株对幽门螺旋杆菌有抑制作用，测量发现不同的菌株出现的抑菌圈大小不等，说明不同乳酸菌对幽门螺旋杆菌的的抑制能力亦不相同。如下表4、图7～9所示。

 表4  不同乳酸菌对幽门螺旋杆菌的抑菌能力的比较    单位（mm）

Table 4  Comparison of inhibit effect from Helicobacter pylori of different lactic acid bacteria

图7 幽门螺旋杆菌生长情况          图8 对照菌株BB-12的抑菌情况

Fig7 Growth of Helicobacter pylori      Fig8 Inhibit effect from Helicobacter pylori of BB-12

图9 鼠李糖乳杆菌LV108的抑菌情况     

Fig 9 Inhibit effect from Helicobacter pylori of strain Lactobacillus rhamnosus LV108

从表4及图7～9可以看出，供试菌株对幽门螺旋杆菌大部分都有抑制作用。鼠李糖乳杆菌LV108对幽门螺旋杆菌抑制作用较强，抑菌圈直径12.7mm，高于BB-12，BB-12的抑菌效果为9.8mm。

3.1.4鼠李糖乳杆菌LV108粘附能力的比较

3.1.4.1不同乳酸菌单菌株对Caco-2细胞的粘附

3.1.4.1.1单菌株的粘附情况

被测试的2株菌株中，鼠李糖乳杆菌LV108(图9)粘附得较好，均匀地分布在细胞周围，对照菌株BB-12粘附亦较好，均匀紧密地分布在细胞周围（图10）。

图9 LV108对Caco-2细胞粘附的形态观察  图10  BB-12对Caco-2细胞粘附的形态观察

Fig 9, 10  Form observation of strain Lactobacillus rhamnosus LV108, BB-12 adhered to Caco-2

3.1.4.1.2单菌株的粘附能力

  对照菌株BB-12和鼠李糖乳杆菌LV108粘附能力如表5所示。

表5   不同乳酸菌单菌株对Caco-2细胞的粘附

                  Table 5  Adherence of lactic acid bacteria to Caco-2         n=13

鼠李糖乳杆菌LV108菌株粘附平均值为12.9±2.74个/细胞，对照标准菌株BB-12粘附能力10.7±2.46。从结果中可以看出，鼠李糖乳杆菌LV108粘附能力与BB12相当。

3.1.4.1.3 乳酸菌与大肠杆菌对细胞的竞争性粘附

3.1.4.1.3.1乳酸菌对大肠杆菌细胞粘附力的影响

先用乳酸菌粘附2h，吸出菌液，经pH7.4无菌PBS清洗2次，再用大肠杆菌粘附2h，观察粘附情况。结果如下表6所示。

表6   先用乳酸菌粘附后用大肠杆菌粘附的情况

  Table 6  Adherence to Caco-2 with lactic acid bacteria later with E.coli

先用乳酸菌粘附后，大肠杆菌平均粘附数从空白时的35.7个/细胞分别降至LV108：0；BB12：2.4。结果显示，鼠李糖乳杆菌的抑制作用，比标准菌株BB-12强。

3.1.4.2.3.2大肠杆菌对乳酸菌粘附力的影响

先用大肠杆菌粘附2h，吸出菌液，经pH7.4无菌 PBS清洗2次，再用乳酸菌粘附2h，观察粘附情况。结果如下表7：

       表7  先用大肠杆菌粘附后用乳酸菌粘附的情况

  Table 7  Adherence to Caco-2 with E.coli later with lactic acid bacteria

先用大肠杆菌粘附，再用乳酸菌粘附时，对照菌株BB-12和鼠李糖乳杆菌LV108并不能使大肠杆菌粘附减少，平均仍为36.7个/细胞，与空白大肠杆菌粘附数相差不大。

3.1.5抗氧化性试验

ICR品系小鼠连续给药8天，在末次给药后摘取ICR品系小鼠眼球取血，静置，分离血清。分别按黄嘌呤氧化酶法（试剂盒）测定血清中的SOD含量；按硫代巴比妥酸法（试剂盒）方法测定血清中的MDA。结果见表8。

表8 受试物抗氧化功能试验测定结果

Table 8  The results of anti-oxidation effect of test mice

与对照组比较 * P<0.05，** P<0.01

从试验结果可以看出：

（1）连续灌胃给予受试品LV108，MDA含量有所降低，与对照组比较差异有显著性。血清SOD活力有增高趋势，但与对照组比较差异无显著性。

（2）连续灌胃给予受试品HansenBB-12，血清SOD活力有增加趋势，但与对照组比较差异无显著性，MDA含量降低，与对照组比较差异有显著性。

3.2鼠李糖乳杆菌LV108加工特性的研究

3.2.1发酵特性研究

将鼠李糖乳杆菌LV108接种到灭菌的11%的脱脂乳中，在37℃发酵过程中，鼠李糖乳杆菌LV108活菌数量及pH变化如图11所示。

图11  图9鼠李糖乳杆菌LV108发酵过程中活菌数量及pH值的变化

Fig11  The growth and pH of Lactobacillus rhamnosus LV108 in skim milk

由图11可以看出：鼠李糖乳杆菌LV108在37℃培养下随着发酵时间的延长，活菌数在不断的增大，pH在不断在减小。活菌数在前15h内逐渐增大，变化趋势比较平缓；而在15～19h内活菌数量迅速增大，并在19h活菌数量达到最高，最高达到2×10¹⁰cfu/mL。在19h后活菌数量稍有增加后趋于平缓。而pH在前15h内逐渐减小，在15～19h内pH迅速减少，在19h后pH值稍有减少后趋于平缓，最低pH值达到3.3。

3.2.2贮藏特性研究

将鼠李糖乳杆菌LV108发酵乳在不同温度4℃、15℃、25℃下，贮藏30天，鼠李糖乳杆菌LV108活菌数量及酸度的变化情况如图12、13所示。

由图可以看出：鼠李糖乳杆菌LV108具有良好的贮藏特性，在4℃贮藏30天，活菌数量下降较小，其仍然超过10⁸cfu/mL，酸度变化不大。但是在15℃贮藏过程中，活菌数量在第10天后逐渐下降，酸度升高；30天时活菌数量为10⁵ cfu/mL。在25℃贮藏活菌数量急剧下降，到20天基本无活性细胞。

图12 鼠李糖乳杆菌LV108在不同温度下贮藏的活菌数量变化

图13  鼠李糖乳杆菌LV108活菌数量及酸度的变化

3.5.3冷冻和干燥能力研究

3.5.3.1不同干燥方法对鼠李糖乳杆菌LV108存活率的影响

将BB-12和鼠李糖乳杆菌LV108发酵乳采用喷雾干燥和冷冻干燥，细菌存活率如3-29图所示。

1-脱脂乳BB-12菌 2-脱脂乳LV108菌 3-豆芽汁BB-12菌 4-豆芽汁LV108菌 5-平均粗存活率

图14 不同干燥方法下乳酸菌的存活率

Fig14  Livability of lactic acid bacteria in freeze-dry and spray-dry

由图14可以看出在冷冻干燥下，用脱脂乳培养的鼠李糖乳杆菌LV108存活率达到56.7%，而BB-12仅为44.8%，但在喷雾干燥下的存活率仅达到0.70%左右，冷冻干燥效果明显好于喷雾干燥。

3.5.4不同干燥方法对鼠李糖乳杆菌LV108活力的影响

将喷雾干燥和冷冻干燥后的鼠李糖乳杆菌LV108干粉接种于质量分数为12%的脱脂牛乳中，发酵期间其酸度和pH值变化如图。

图15  鼠李糖乳杆菌LV108经不同方法干燥后发酵酸度的变化

Fig15  Livability of lactic acid bacteria in freeze-dry and spray-dry

图16  鼠李糖乳杆菌LV108经不同方法干燥后pH的变化

Fig16  Livability of lactic acid bacteria in freeze-dry and spray-dry

由图6、图7看出：各种处理方法对Q菌活力的影响大小顺序为：喷雾干燥〉干燥前〉冷冻干燥。

由于益生菌对氧、酸极为敏感，使其储存稳定性很差以及易受胃酸失活，功能活性丧失。为此，将益生菌微胶囊化十分必要。选择具有一定耐性的菌株和具有良好阻隔性能的壁材对微胶囊化很重要。目前，益生菌的微胶囊化已发展了锐孔—凝固浴，流化床包膜、熔化分散冷凝、乳化交联、相分离，喷雾干燥、吸附等方法^[55]。在未来开发益生菌发酵乳制品时，可以充分利用现代生物技术原理，采用新型发酵技术，提高发酵乳产品中的益生菌数量，并可添加天然保护剂，保持益生菌在产品中的活性。

3.5.4冷冻干燥对菌种粘附能力和抑菌特性的影响

鼠李糖乳杆菌LV108经过冷冻干燥后，经过3代活化后，细菌的粘附能力和抑菌特性，均与未冻干前无显著差异。

4 结论

4.1鼠李糖乳杆菌LV108功能特性

4.1.1发酵乳急性毒性实验研究

4.1.2耐酸和耐胆汁酸盐的研究

（1）所试鼠李糖乳杆菌LV108和BB-12两个菌株均可以在pH2、0.3%胆汁酸盐中存活5h,在pH3中存活率高于pH2中的存活率。

（2）两个菌株在pH3中，OD值随着胆汁酸盐浓度的增加、培养时间的延长而增加，说明这两个细菌均具有生长能力。且两个菌株在pH3、0.2%胆汁酸中OD值随着培养时间的延长而增加，说明在这样的环境中它能够继续生长。

（3）鼠李糖乳杆菌LV108在相同pH值、不同胆汁酸盐浓度下，其耐受能力高于BB-12在pH2、0.4%的胆汁酸盐浓度下的耐受能力。

4.1.3抑制致病菌试验

4.1.3.1对大肠杆菌的抑制作用

（1）利用AWDA法进行实验发现：鼠李糖乳杆菌LV108对大肠杆菌的抑菌圈直径达12.6㎜，与标准菌株BB-12相比高出4.1㎜，抑菌能力相对较强。

（2）通过混合培养法抑菌效果比较发现，实验菌株与大肠杆菌混和培养24h后，大肠杆菌的菌数均有所下降，下降程度明显，说明都具有抑制大肠杆菌生长的能力。以BB-12抑制大肠杆菌的对照看来，鼠李糖乳杆菌LV108较强，活菌数仅为2.0×10³cfu/mL。

用AWDA法和混合培养法两种方法进行实验，单扩法中抑菌圈较大的在混合法中大肠杆菌的检出率相对较低，两者的实验结果基本一致，但也不完全吻合。

4.1.3.2对幽门螺旋杆菌的抑制作用

两种供试菌株对幽门螺旋杆菌都有抑制作用。鼠李糖乳杆菌LV108对幽门螺旋杆菌抑制作用较强，抑菌圈直径12.7mm，高于BB-12，BB-12的抑菌效果为9.8mm。

4.1.4鼠李糖乳杆菌LV108粘附能力的比较

4.1.4.1不同乳酸菌单菌株对Caco-2细胞的粘附

先用乳酸菌粘附，后粘附大肠杆菌时，可以得出如下结论：

（1）从试验的2株乳酸菌的比较来看，供试菌株对致病性大肠杆菌粘附基本上具有抑制作用，鼠李糖乳杆菌LV108粘附得较好，均匀地分布在细胞周围，对照菌株BB-12粘附亦较好，均匀紧密地分布在细胞周围。

（2）从粘附数量来看，试验的2株乳酸菌中，鼠李糖乳杆菌LV108菌株粘附平均值为12.9±2.74个/细胞，对照标准菌株BB-12粘附能力10.7±2.46。从结果中可以看出，鼠李糖乳杆菌LV108粘附能力与BB12相当。

4.1.4.2乳酸菌与大肠杆菌对细胞的竞争性粘附

（1）先用乳酸菌粘附后，大肠杆菌平均粘附数从空白时的35.7个/细胞分别降至LV108：0；BB-12：2.4。结果显示，鼠李糖乳杆菌的抑制作用，比标准菌株BB-12强。

（2）先用大肠杆菌粘附，再用乳酸菌粘附时，对照菌株BB-12和鼠李糖乳杆菌LV108并不能使大肠杆菌粘附减少，平均仍为36.7个/细胞，与空白大肠杆菌粘附数相差不大。

从竞争性粘附结果来看，双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌LV10对大肠杆菌竞争性粘附能力较强，而从大肠杆菌先粘附后用乳酸菌粘附的结果来看，大肠杆菌粘附数量并未因乳酸菌的粘附而降低，这与占位保护有关。 

4.1.5抗氧化性试验

从试验结果可以看出：

（1）连续灌胃给予受试品鼠李糖乳杆菌LV108，MDA含量有所降低，与对照组比较差异有显著性。血清SOD活力有增高趋势，但与对照组比较差异无显著性。

（2）连续灌胃给予受试品HansenBB-12，血清SOD活力有增加趋势，但与对照组比较差异无显著性，MDA含量降低，与对照组比较差异有显著性。 

综合以上对乳酸菌功能特性的研究结果来看：

1、本确定的鼠李糖乳杆菌LV108安全性良好；

2、从耐酸及胆盐情况来看，鼠李糖乳杆菌LV108比BB-12要好；

3、从对大肠杆菌的抑制作用来看，鼠李糖乳杆菌LV108比BB-12要好；

4、对幽门螺旋杆菌的抑制作用来看，鼠李糖乳杆菌LV108与BB-12相当；

5、从粘附作用来看，鼠李糖乳杆菌LV108与BB-12相当；

5、从抗氧化能力来看，鼠李糖乳杆菌LV108与BB-12相当。

研究结果表明：本研究确定的一株鼠李糖乳杆菌LV108是性能非常优良的乳酸菌，比BB-12性能更好。 

4.2鼠李糖乳杆菌LV108加工特性

4.2.1发酵特性研究

研究了鼠李糖乳杆菌LV108的发酵特性，结果表明：鼠李糖乳杆菌LV108在37℃培养下随着发酵时间的延长，活菌数在不断的增大，pH在不断在减小。活菌数在前15h内逐渐增大，变化趋势比较平缓；而在15～19h内活菌数量迅速增大，并在19h活菌数量达到最高，最高达到2×10¹⁰cfu/mL。在19h后活菌数量稍有增加后趋于平缓。而pH在前15h内逐渐减小，在15～19h内pH迅速减少，在19h后pH值稍有减少后趋于平缓，最低pH值达到3.3。

4.2.2贮藏特性研究

鼠李糖乳杆菌LV108具有良好的贮藏特性，在4℃贮藏30天，活菌数量下降较小，其仍然超过10⁸cfu/mL，酸度变化不大。但是在15℃贮藏过程中，活菌数量在第10天后逐渐下降，酸度升高；30天时活菌数量为10⁵ cfu/mL。在25℃贮藏活菌数量急剧下降，到20天基本无活性细胞。

4.2.3冷冻和干燥能力研究

从研究结果可以得出如下结论：

（1）将BB-12和鼠李糖乳杆菌LV108发酵乳采用喷雾干燥和冷冻干燥，可以看出在冷冻干燥下，用脱脂乳培养的鼠李糖乳杆菌LV108存活率达到56.7%，而BB-12仅为44.8%，但在喷雾干燥下的存活率仅达到0.70%左右，冷冻干燥效果明显好于喷雾干燥。

（2）各种处理方法对Q菌活力的影响大小顺序为：喷雾干燥〉干燥前〉冷冻干燥。

（3）鼠李糖乳杆菌LV108经过冷冻干燥后，经过3代活化后，细菌的粘附能力和抑菌特性，均与未冻干前无显著差异。 

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