植物乳杆菌发酵生产共轭亚油酸

摘 要 共轭亚油酸是一种具有多种生理活性的天然脂肪酸。以盐生植物紫花苜蓿的种籽油为底物，用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）6026催化紫花苜蓿籽油中的亚油酸转化为共轭亚油酸。通过单因素试验分析了发酵过程中pH值、预培养、温度和时间对生产共轭亚油酸的影响。
关键词 紫花苜蓿籽油；共轭亚油酸；植物乳杆菌；单因素
中图分类号 Q815
20世纪50年代末，一些科学家发现，在反刍动物中，亚油酸能被其转化成 c-9，t-11的共轭亚油酸（conjugated linoleic acid,简称CLA），并且认为是厌氧的溶纤维丁酸弧菌亚油酸异构酶的作用。到70年代末，Pariza等最先发现烧烤牛肉的提取物具有抗癌作用，经过对提取物的分析最终鉴定认为抗癌成分是共轭亚油酸的混合物[1-3]。自从 Pariza 发现 CLA 具有抗癌作用以来，人们越来越关注 CLA，欧洲还成立了专门研究 CLA 的机构[4]。CLA 是一系列含有共轭双键、具有位置和构象异构的十八碳二烯酸的总称，是必需脂肪酸亚油酸（cis-9,cis-12-octadecadienoic acid, 顺-9，顺-12-十八碳二烯酸）的异构体。在人类和动物中最主要的异构体是c-9，t-11-十八碳二烯酸[5，6]，被命名为瘤胃酸（rumenic acid）。c-9,t-11 和t-10,c-12是自然界中含量最高的异构体。
我国盐生植物资源丰富，其利用率却不高。其中盐生植物紫花苜蓿的种籽油的含油量达到12%，在紫花苜蓿籽油脂中，亚油酸占总脂肪酸含量的30%～35%，另外还含有少量亚麻酸。
本试验以MRS作培养基，植物乳杆菌为出发菌株，以盐生植物紫花苜蓿的种籽油为底物，摸索了各个发酵条件对生产共轭亚油酸（CLA）的影响。试验中所用的乳酸菌为兼性厌氧菌，易培养，无毒，有较高的实用价值和应用前景。
1 材料
菌株：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）6026由中科院微生物所提供。
培养基：MRS培养基。
主要试剂：紫花苜蓿籽油自行提取制得；共轭亚油酸纯品（CLA）购于Sigma公司（纯度>99%）。
2 方法
2.1 样品的预处理
2.1.1 菌种的活化
将保藏在冰箱的植物乳杆菌活化在液体的MRS培养基中，混匀后置37 ℃恒温箱中培养9～12 h后，选取菌液作革兰氏染色、镜检，确定纯后，接种于液体培养基中反复活化。
2.1.2 菌种的预培养
在准备培养活化好的菌种之前，在培养基中加入紫花苜蓿籽油2.5～25 μl，接种量为5%，摇匀后于37 ℃预培养8～26 h作为接种物。
2.2 发酵方法
100 ml三角瓶装20 ml的MRS培养基，用磷酸钠溶液调pH值至5.8～8.0，将活化的菌种按5%接种，接入紫花苜蓿籽油10 μl，混匀，在20～50 ℃下静置培养24 h。
2.3 共轭亚油酸的提取方法
取发酵液0.5 ml，溶解于1.5 ml异丙醇，然后添加1 ml正己烷，在漩涡振荡器上混匀3 min，然后4 000 r/min离心10 min，吸取上清液，用氮气吹干，然后溶解于5 ml正己烷中进行检测。
2.4 培养基中CLA产量的测定
以正己烷为溶剂，将CLA标样配成不同浓度的溶液，以正己烷为参比，在234 nm处测定其吸光值，以CLA浓度（g/l）为横坐标，吸光值（ABS）为纵坐标，绘制标准曲线（见图1）。

以不接种的培养基为参比，用紫外分光光度计测定在特征吸收峰234 nm处的吸收值，根据标准曲线计算发酵液中CLA的含量。已知苜蓿籽油中含LA 30%，通过公式CLA转化率（％）=生成CLA的量/苜蓿籽中含有LA的量，计算CLA转化率。参比培养基中加入与样品同量的苜蓿籽油，不接菌种，其它步骤同样品[9，10]。
3 结果与讨论
3.1 预培养接入的油量对生产CLA的影响(见图2)


预培养中添加苜蓿籽油和不添加苜蓿籽油对发酵培养基中CLA转化率会有一定影响。如图 2 所示，种子培养基中加入苜蓿籽油会较明显的提高CLA转化率。另外加入苜蓿籽油量的多少也会带来不同的CLA转化率，其中在加入苜蓿籽油5 μl时CLA转化率达到最高。这表明了催化LA生成CLA的该乳杆菌中的氢化酶在预培养过程中受到了诱导作用。这与Y.J.KIM[11]在用全脂牛奶培养基发酵生产CLA中预培养的效果不同。说明不同培养基、不同的菌种对生产CLA的影响是不同的。
3.2 预培养时间对生产CLA的影响(见图3)

为了进一步研究预培养对生产CLA的影响，由图3可见，在预培养过程中，改变预培养的时间，研究其在发酵培养过程中对CLA转化率产生的影响。当预培养时间由8 h变为14 h，CLA转化率有较明显的提高。说明在预培养阶段，当种子液中接入种籽油后预培养的第14 h该乳杆菌被诱导产生的生物氢化酶效果最好。当预培养时间由14 h继续增加，CLA转化率开始呈现下降趋势。可能由于时间的延长该乳杆菌产生生物氢化酶的过程发生了逆反应，其作用机理有待进一步研究。
3.3 pH值对生产CLA的影响(见图4)

用磷酸钠缓冲溶液将发酵培养基的pH值调至5.8～8.0。通过图4可以看出，在pH值7.4时CLA转化率最高。生产CLA主要是依靠乳杆菌中的生物酶对LA进行转化[12]，这可能是因为pH值对乳杆菌中的亚油酸异构酶产生影响的综合表现，过酸或过碱都可能引起生物酶中分子构象的改变，从而影响酶的活性。另外试验中使用的植物乳杆菌本身生长的最佳pH值也在7左右，因此在pH 值7.4时，由该乳杆菌催化转化LA生成的CLA最多。
3.4 温度对生产CLA的影响(见图5)

由图5可以看出，在该乳酸菌发酵制取CLA的过程中改变发酵条件中的温度，CLA转化率会有较明显的变化。在20 ℃温度较低时,CLA转化率不到10%; 随着温度升高至37 ℃，CLA转化率也升高到30%; 而当温度继续升高到50 ℃，CLA转化率呈下降趋势。分析其原因可能是该乳杆菌中的生物氢化酶的最适温度在37 ℃，过低的温度不能供应发酵反应需要的热量，不利于菌种的生长，导致菌体产酶的生化反应不能顺利进行；而过高的温度会加速酶的变性而使该酶失活。
3.5 CLA转化率的时间曲线和菌体的生长曲线（见图6）

由图6可以看出，菌体在发酵进程中，5～10 h之间为对数生长期，此期间生物量快速增加；生长约12 h进入稳定期，但是CLA转化率此时呈高速增长阶段；生长约21 h时，CLA转化率达到最大，而后CLA转化率呈下降趋势。另外，从图6中也可以看出，加入油样的菌株生长会受到一些抑制。
4 结论
本试验以盐生植物紫花苜蓿的种籽油为底物，利用乳杆菌发酵生产CLA。研究了预培养接入的油量、预培养时间，pH值和温度对CLA转化率的影响，并研究了菌种的生长曲线和CLA转化率的时间曲线。研究表明，种子培养基中加入苜蓿籽油会较明显的提高CLA转化率，但是预培养的时间需要控制在一定范围内，经试验证实，在预培养时间为14 h时CLA转化率较高；在pH值7.4时，由植物乳杆菌催化转化的CLA最多；温度在37 ℃时CLA转化率最大。本研究所采用菌株具有安全性和生物转化产生CLA异构体的专一性，同时充分的利用了我国大量的盐碱地和数量众多的盐生植物，为人类提高饮食行业中CLA产品的应用开辟了广阔的前景。
参考文献
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11 Y. J. KIM, R.H. Liu. Increase of conjugated linoleic acid content in Milk by Fermentation with Lactic Acid Bacteria[J]. Food Chemistry and Toxicology,2002,67:1 731～1 737
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（编辑：高 雁，snowyan78@tom.com）