丁酸梭菌益生性及抗逆性研究

摘要：本研究以一株丁酸梭菌C-101作为实验菌株，从抑菌能力，耐热性，耐人工胃液，人工肠液，人工胆盐能力几个方面，分析了其作为微生态制剂菌种的潜力，实验结果可知，该菌株耐热性良好，80摄氏度处理5min，存活率仍达到99.0%，人工胃液处理2h，存活率87.8%，人工肠液处理2.5h，存活率98.9%，0.4%胆盐处理，生长情况良好，能够抑制常见的致病菌：大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，单增李斯特菌，益生性能优良，可以作为微生态菌剂开发菌种。

关键词：微生态制剂，益生性，抗逆性

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）属于厌氧革兰氏阳性菌，电子显微镜下观察其菌体形态呈直或略有弯曲的杆状，单个或成对，部分呈丝状，短链，白色略带灰感，细菌直 径为（0.6～1.4）×（2.7～7.3）μm，菌体中间略饱满，两端呈 钝圆形，周身有鞭毛，具运动性[1]，广泛存在于奶酪、天然酸奶、酒窖泥、土壤及人与动物粪便中[2]。丁酸梭菌代谢过程中主要产物为丁酸，在反刍动物肠道中，丁酸能够被结肠上皮细胞代谢利用并产生能量。做为产芽孢菌，丁酸梭菌具有耐热、耐酸、耐多种抗生素等能力[3]，可调节动物肠道内的微生态平衡，具有调整肠道功能的作用。丁酸梭菌还具有抗癌、提高机体免疫力、抗氧化等作用，目前已被制成微生态制剂广泛地用于保健食品[4]。

2009年丁酸梭菌被农业部批准，允许作为活菌制剂在饲料中添加。微生态制剂能否作为活菌制剂被应用，取决于菌种的益生性能，以及其在后续加工过程中的抗逆性，能够保证微生态制剂有效活菌数及产品的稳定性。丁酸梭菌作为一种梭状芽孢杆菌，具有一定耐高温、耐动物胃肠道环境的能力，但是这些特性在不同菌株之间存在较大的差异。所以，研究丁酸梭菌的益生性能及抗逆性显得尤为重要，本研究中，以实验室筛选得到的一株丁酸梭菌C-101为实验菌株，研究了其高温耐受能力，抑菌能力，耐胃酸，耐胆盐能力，为该菌株的应用提供了理论基础。

1.       实验材料与方法

1.1菌株

丁酸梭菌C-101：由好实沃生物保藏提供。

指示菌：大肠埃希氏菌（Escherichiacol），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），单核细胞增生李斯特菌（Listeria Monocytogenes，肠炎沙门氏菌（S. enteritidis）。

1.2实验材料

强化梭菌培养基（reinforced clostridial medium，RCM）、LB琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂（tryptic soy agar，TSA）培养基。

种子培养基：RCM液体培养基。

丁酸梭菌发酵培养基：蛋白胨 10.0 g，牛肉粉 10.0 g，酵母粉3.0 g，葡萄糖5.0 g，可溶性淀粉1.0 g，L-半胱氨酸盐粉 3.0 g，磷酸氢二钾 0.05 g，硫酸镁0.08 g，硫酸锰0.002 g，纯化水1000 mL，pH 7.0[5]。

以上培养基制备完成后均需高压灭菌备用，灭菌温度121℃，灭菌时20min。

人工胃液，人工肠液的配制参照《中国药典》。

1.3 实验方法

1.3.1抑菌能力实验

菌种准备：将甘油管保藏的丁酸梭菌C-101 0.1 mL接种到10 mL液体RCM培养基中，厌氧培养18 h，备用。将活化好的菌株接种于种子培养基，厌氧培养24 h，再按5%接种量，接种于发酵培养基，37℃厌氧培养48h后备用。

将大肠杆菌、沙门氏菌划线接种于LB固体培养基上37 ℃培养24 h， 依次用无菌生理盐水洗脱菌体，制备菌悬液，并将菌悬液的菌浓度稀释为106CFU/mL，备用。 

将金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌接种于TSA固体培养基上，于37 ℃条件下培养24 h，依次用生理盐水洗脱，制备菌浓度为106CFU/mL左右的菌悬液后，备用。

指示菌平板的制备：采用双层平板法制备指示菌平板。取15 mL培养基加入到培养皿，凝固后作为下层；取5 mL含2%不同指示菌菌悬液的培养基加入凝固后的下层培养基上作为上层，待用。        

采用牛津杯法测定抑菌活性。在牛津杯中加入200 μL丁酸梭菌发酵上清液，于37 ℃条件下 培养16～18 h，观察并测量抑菌圈直径。每组测定两个重复。

1.3.2 菌悬液的制备

将活化好的菌株C-101种至种子培养基中，37 ℃厌氧培养24 h后，按5%接种量接种至发酵培养基，37 ℃厌氧培养48 h，发酵培养结束后，3 000 r/min离心10 min，收集菌体，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤两次后重悬，使菌体浓度为4.5×108CFU/mL，备用。

1.3.3耐热性试验 

取上述菌液样品1 mL到含9 mL甘油溶液（80%甘油）的试管中，充分混匀，分别置于60 ℃、70 ℃、80 ℃、 90 ℃、100 ℃的水浴中处理5 min，置于0 ℃冰水混合物中冷却，3000 r/min离心10 min，收集菌体，PBS洗涤两次后重悬，采用梯度稀释平板法测定其活菌数，每个样品重复3次，计算存活率，其计算公式如下： 

存活率=处理后活菌数/处理前活菌数×100%

1.3.4人工胃液耐受性试验 

取上述样品菌液1 mL到9 mL人工胃液中，人工胃液最终pH值调为1.5左右，振荡混匀，37 ℃水浴，每隔0.5 h取样，将经过人工胃液处理后的菌悬液，3000 r/min离心10 min，PBS洗涤两次后重悬，梯度稀释法进行计数，每个样品3个平行，计算存活率。 

1.3.5人工肠液耐受性试验 

   取上述样品菌液1 mL到9 mL人工肠液中振荡混匀， 37 ℃水浴2.5 h，毎隔0.5 h取样，3 000 r/min离心10 min， PBS缓冲液洗涤两次后重悬，采用梯度稀释法进行活菌计数，每个样品3个平行，计算存活率。 

1.3.6胆盐耐受性试验 

在RCM液体培养基中加入不同浓度的猪胆盐，使其浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，混匀，121 ℃、 15 min灭菌后备用。按107 CFU/mL接种量分别接种丁酸梭菌C-101，厌氧培养24 h，检测活菌数，每个样品重复3次。

2.       实验结果与讨论

2.1 抑菌实验

丁酸梭菌代谢产生的有机酸能够降低肠道pH，同时产生细菌素，抑制肠道中致病菌的生长，丁酸梭菌对常见致病菌抑制能力结果如表1所示，结果显示，丁酸梭菌C-101对常见致病菌具有显著抑制能力，由于其产生的抑菌物质非单一有机物，所以，其抑菌物质仍待进一步的研究。

表1 C-101对常见致病菌抑菌效果

3.2 耐热性实验

由表2可知，丁酸梭菌C-101具有良好的耐热性，80摄氏度处理5min后，存活率仍可达99.5%，温度继续升高，存活率下降，对于饲料加工过程，需缩短热处理时间。

 

表2 C-101耐热性能

2.3人工胃液耐受性

表3 C-101人工胃酸耐受性

动物胃液为酸性，pH一般在2.5-3.0[6]，微生态制剂能否达到肠道发挥效应，需经过胃液，并保持一定的活性，由表3可知，丁酸梭菌经人工胃液处理后2.5h后活菌数仍能够保持较高水平，活性降低13.3%，性状优良，可以作为微生态制剂生产用菌种。

2.4人工肠液耐受性

表4 C-101人工肠液耐受性

由表4可知，丁酸梭菌C-101对人工肠液具有很好的耐受性，人工肠液处理2.5 h，活菌数均为 4.45×108 CFU/mL，存活率98.9%，说明该菌株在肠道内保持较高的存活率。 

2.5 胆盐耐受性

                                           图1 C-101胆盐耐受性

动物肠道内胆盐的质量分数约为0.03%-0.30%，菌株能否在肠道中定植，取决于菌株对胆盐的耐受能力[7]。由图1可知，菌株C-101对胆盐具有很好的耐受性，在人工胆盐浓度0.4%条件下能够正常生长，当胆盐浓度达到0.5%时受到抑制，可以保证其顺利地通过小肠，并最终成功定殖于动物肠道后端。

3.       结论

本研究以实验室分离保藏的一株丁酸梭菌C-101为实验菌株，对其抑菌能力，耐热性，人工胃液，人工肠液，人工胆盐耐受性，实验结果显示，该菌株对常见致病菌由显著的抑制效果，耐热性良好，能够耐受饲料制粒或加工过程的热处理过程，对胃酸，肠液，胆盐耐受性能优良，具有良好的应用潜力。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

参考文献

[1]                      赵建新，张灏，田丰伟. 丁酸菌的分离、鉴定及筛选[J]. 食品与生物 技术学报，2002（6）：597-601，612.

[2]                      桂国弘，徐娥，杨华，等．丁酸梭菌调节肠道健康的作用机制 ［J］． 饲料研究，2016( 22) : 42－46． 

[3]                      田召芳，李春蕾，党安坤． 丁酸梭菌作用机理与研究进展［J］． 中国畜禽种业，2017( 8) : 36－38．

[4]                      熊祖明，袁杰利． 酪酸梭菌的研究与应用进展［J］． 中国微生态学杂志，2011，23( 12) : 1143－1145．

[5]                      谢丽静，王丽，王伟华等，丁酸梭菌优良菌株LXYB-2抑菌活性及抗逆性研究［J］，中国酿造，2018,37（6）:91-96

[6]                      陈桂芳，刘艳，单春乔，等. 费氏丙酸杆菌生物学特性及与5株益生菌拮抗性试验研究[J]. 中国酿造，2018，37（1）：69-73.

[7]                      张媛媛. 复合芽孢杆菌制剂发酵工艺及其耐受性研究[D]. 哈尔滨：东北林业大学，2012.