植物乳杆菌代谢产物对产气荚膜梭菌的影响
摘要：植物乳杆菌在代谢过程中产生的乳酸菌素具有安全、无毒的抑菌作用，乳酸菌素是由核糖体合成并分泌至胞外具备生物活性的多肽，当其达到一定浓度时可抑制致病菌或腐败菌的生长，因此作为生物防腐剂广泛应用于各种发酵食品中。本文用一株分离得到的植物乳杆菌HEW-ZW5进行发酵和抑菌研究，发现其发酵液在pH=8.0以下对产气荚膜梭菌抑菌均达到高敏效果，在100℃高温处理后其抑菌效果没有明显变化。
关键词：植物乳杆菌，乳酸菌素，致病菌，产气荚膜梭菌
产气荚膜梭菌又称魏氏梭菌，是一种畜禽养殖中的条件致病菌，广泛存在于人畜的粪便、污水、土壤等地方。能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，同时分泌的毒素能引起致死性，因而对畜禽养殖造成严重经济损失[1]。
在乳酸菌中，最大的类群是乳杆菌属，而其中的植物乳杆菌就是一类特别的乳酸菌，其分布广泛，已被证实有能力在人类和其他哺乳动物的肠道中定植[2]，并具有代谢产物丰富和产酸、耐酸能力强的特点 [3]。植物乳杆菌的抗菌物质主要有机酸[4]、脂肪酸、短肽[5]等物质，能产生6种有机酸，包括乳酸、乙酸和丙酸等，可抑制霉菌的生长。其代谢产物中乳酸菌素是由核糖体合成并分泌至胞外的一类多肽类物质，主要通过破坏病原体外膜的完整性而起到抗菌作用[6]，
本文利用一株分离得到的植物乳杆菌HEW-ZW5进行发酵实验，研究发现其代谢产物在pH=8.0以下对产气荚膜梭菌均有高敏的抑菌效果，且耐热稳定性好，在100℃水浴处理10min后其抑制产气荚膜梭菌的效果没有明显变化。
1实验材料与方法
1.1菌种
植物乳杆菌HEW-ZW5、产气荚膜梭菌CICC-毒素A型，由北京好实沃生物技术有限公司提供。
1.2培养基
MRS培养基（g/L）：
蛋白胨 10g 牛肉膏 10g 酵母膏 5g 葡萄糖 20g 柠檬酸氢二铵 2g
无水乙酸钠 5g MgSO4.7H2O 0.58g MnSO4.1H2O 0.25g
K2HPO4.3H2O 2g 吐温-80 1ml pH=7.0 115℃ 灭菌30min,
RCM培养基、TSC培养基均购自青岛海博生物技术有限公司
按照厂家说明书配制，其中RCM固体培养基加1.3%琼脂粉进行灭菌。
1.3实验方法
1.3.1 培养皿准备
RCM固体培养基按照115℃灭菌30min，灭菌完成后倒板，板子放37℃培养箱倒置空培养48h，取出放4℃冰箱备用。
1.3.2 菌体培养过程
植物乳杆菌：取甘油管1支，用接种环划线至MRS固体板上37℃培养48h长出单菌落，接一个单菌落于MRS 50ml液体培养基中，37℃ 130rpm培养20h，取6ml菌悬液接种于MRS 300ml液体培养基中，37℃ 130rpm培养24h。
产气荚膜梭菌：取甘油管1支，用接种环划线至TSC固体板上37℃厌氧培养20h长出单菌落，接一个单菌落于RCM 50ml液体培养基中，37℃ 静置厌氧培养24h。
1.3.3 实验过程
植物乳杆菌上清液分离及处理：
取植物乳杆菌发酵完成液加入50ml灭菌的离心管中，12000rpm 离心5min，收集离心上清液。
发酵上清耐热稳定性处理：
将发酵上清10ml装入无菌的试管中，将其放入不同温度条件50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴处理10min后迅速冷却备用。
将发酵上清10ml装入无菌的试管中，将其放入85℃水浴处理10min、20min、30min后迅速冷却备用。
发酵上清不同pH处理：
将发酵上清20ml装入无菌的50ml三角瓶中，用NaOH 溶液将发酵上清液 pH 调节至 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、8.5并保持 30 min。
对产气荚膜梭菌抑菌实验过程：
将培养好的产气荚膜梭菌菌悬液100ul加入到空培好的RCM固体板上，立即用涂布器涂布均匀，用灭菌的1ml蓝色枪头砸孔，加入经过同一时间不同温度处理、同一温度不同时间处理和不同pH处理的植物乳杆菌发酵上清200ul于每个孔中，静置放置约1.5h后于37℃ 厌氧培养箱培养20h后观察抑菌圈大小。
2实验结果
2.1 同一时间不同温度处理对产气荚膜梭菌的影响
将植物乳杆菌发酵上清液经过50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴处理10min后，对产气荚膜梭菌的抑菌效果见表1。
表1 不同温度处理对抑制产气荚膜梭菌效果的影响
| 处理温度 | 抑菌圈大小（cm） | 抑菌效果 |
| 发酵上清原液 | 2.45cm | +++ |
| 50℃ | 2.40cm | +++ |
| 60℃ | 2.40cm | +++ |
| 70℃ | 2.35cm | +++ |
| 80℃ | 2.45cm | +++ |
| 90℃ | 2.35cm | +++ |
| 100℃ | 2.40cm | +++ |
2.2 同一温度不同时间处理对产气荚膜梭菌的影响
将植物乳杆菌发酵上清液经过85℃水浴处理10min、20min、30min后，对产气荚膜梭菌的抑菌效果见表2。
表2 同一温度不同时间处理对抑制产气荚膜梭菌效果的影响
| 处理时间 | 抑菌圈大小（cm） | 抑菌效果 |
| 发酵上清原液 | 2.40cm | +++ |
| 10min | 2.35cm | +++ |
| 20min | 2.40cm | +++ |
| 30min | 2.30cm | +++ |
2.3 不同pH处理对抑制产气荚膜梭菌效果的影响
将植物乳杆菌发酵上清液经过pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、8.5处理30min后，对产气荚膜梭菌抑菌效果见表3。
表3 不同pH处理对抑制产气荚膜梭菌效果的影响
| pH | 抑菌圈大小（cm） | 抑菌效果 |
| 发酵上清原液(3.58) | 2.45cm | +++ |
| 4.0 | 2.50cm | +++ |
| 5.0 | 2.40cm | +++ |
| 6.0 | 2.35cm | +++ |
| 7.0 | 2.35cm | +++ |
| 8.0 | 2.30cm | +++ |
| 8.5 | 1.70cm | ++ |
3 结论
本文利用一株从植物中分离得到的植物乳杆菌进行发酵培养，分析其代谢产物中有机酸、短链脂肪酸、乳酸菌素等活性抑菌物质的耐热稳定性及不同pH条件下的对产气荚膜梭菌的抑菌效果，综合发酵实验数据其发酵液pH值为3.58，植物乳杆菌活性为1.5*109cfu/ml，在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴处理10min后，其发酵液上清抑制产气荚膜梭菌的效果无明显变化，在85℃水浴处理10min、20min、30min后，抑菌效果也没有明显变化，在pH 8.0以下抑制产气荚膜梭菌的效果基本一致，均为高敏抑菌效果，其抑菌的活性物质耐热性能比较稳定，为后续开发其价值奠定了基础。
参考文献
[1] 王丽丽. 猪魏氏梭菌病的防治[J]. 现代畜牧科技, 2021 (04):113-114.
[2] Butorac K, Banic M, Novak J, et al. The functional capacity of plantaricin
-producing Lactobacillus plantarum SF9C and S-layer-carrying Lactobacillus brevis SF9B to withstand gastrointestinal transit[J]. Microbial Cell Factories, 2020, 19(1) : 106.
[3] Chen P T, Hong Z S, Cheng C L, et al. Exploring fermentation strategies for enhanced lactic acid production with polyvinyl alcohol-immobilized Lactobacillus plantarum 23 using microalgae as feedstock[J]. Bioresource Technology, 2020, 308 : 123266.
[4] Reis J A, Paula A T, Casarotti S N, et al . Lactic Acid Bacteria Antimicrobial Compounds: Characteristics and Applications[J].Food Engineering Reviews, 2012, 4(2): 124-140.
[5] Hati S, Patel N, Sakure A, et al . Influence of Whey Protein Concentrate on the Production of Antibacterial Peptides Derived from Fermented Milk by Lactic Acid Bacteria[J]. InternationalJournal of Peptide Research and Therapeutics, 2017, 24(1):87-98.
[6] Khalaf H, Nakka S S, Sanden C, et al . Antibacterial effects of Lactobacillus and bacteriocin PLNC8 alphabeta on the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis[J]. BMC microbiology, 2016, 16(1): 188-198.
