嗜酸乳杆菌及其代谢产物对致病菌的抑菌研究
摘要：嗜酸乳杆菌是乳酸菌的一种，属同型乳酸发酵类型，可以调整肠道中的菌群平衡，其分泌的代谢产物对致病菌可以产生抑菌作用。代谢产物中含有丰富的乳酸、乳酸菌素等成分，可以降低动物肠道的pH值，快速抑制有害菌的繁殖。本文用一株分离得到的嗜酸乳杆菌进行研究，发现其产酸能力强，在MRS培养基中pH最低可以达到3.60，代谢产物耐热稳定性好，在最高100℃水浴处理10min后抑制致病菌的效果没有明显变化。
关键词：嗜酸乳杆菌，代谢产物，致病菌，抑菌
嗜酸乳杆菌属乳杆菌科中的乳杆茵属，为革兰氏阳性菌，不运动，无鞭毛，
兼性厌氧菌，在无氧或在低氧的环境下可促进嗜酸乳杆菌的生长，最适生长温度为35-37℃，最适pH值为5.5-6.0，其活菌体耐热稳定性差，但是其产酸能力强，代谢产物丰富，是动物肠道中一类重要的益生菌。
嗜酸乳杆菌在动物肠道内的定植能力强，食用嗜酸孔杆菌后进入到肠道内，能够同其他微生物竞争粘附定植于肠上皮细胞，抑制其它有害菌在肠道内的定植生长，同时可在动物体内代谢产生乳酸菌素和有机酸[1]等活性物质，快速降低肠道内的pH值，也能抑制大肠杆菌、沙门氏菌等病原菌的生长和繁殖，调整肠道中微生物的菌群平衡。
McDonough 等[2]认为嗜酸乳杆菌细胞内的乳糖酶可以直接作用于动物肠道内的乳糖，促进乳糖的分解，明显降低乳糖不耐症症状；许启泰等[3]研究显示用嗜酸乳杆菌连续 7d 饲喂小鼠后，测定各项生理生化指标显示，嗜酸乳杆菌能提高小鼠迟发性变态反应、促进溶血斑形成、增强小鼠巨噬细胞吞噬功能；张英春等[4]研究表明将嗜酸乳杆菌和链球菌以 1:1 混合培养后，检测发现其降低胆固醇的能力明显高于单菌株。
本文利用一株分离得到的嗜酸乳杆菌HEW-A912进行发酵实验，利用MRS液体培养基发酵培养20h左右，发现其最低pH值可以达到3.60，检测总酸含量（以乳酸计）在1.65g/100ml，对发酵上清液进行离心，利用上清液中成分进行抑菌研究，发现其代谢产物耐热稳定性好，在最高100℃水浴处理10min后其抑制致病菌的抑菌效果没有发生明显变化。
1实验材料与方法
1.1 菌种
本实验所用菌株全部由北京好实沃生物技术有限公司提供。
表1 实验使用菌株信息
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菌株名称 |
菌株来源 |
菌株编号 |
备注 |
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嗜酸乳杆菌 |
北京好实沃生物技术有限公司 |
HEW-A912 |
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大肠杆菌 |
购自微生物菌种保藏中心 |
HEW-D101 |
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沙门氏菌 |
购自微生物菌种保藏中心 |
HEW-F101 |
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金黄色葡萄球菌 |
购自中科院微生物所 |
HEW-E101 |
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产气荚膜梭菌 |
购自微生物菌种保藏中心 |
HEW-C201 |
毒素A型 |
1.2 培养基
1.2.1 MRS培养基（g/L）：
蛋白胨 10g 牛肉膏 10g 酵母膏 5g 葡萄糖 20g 柠檬酸氢二铵 2g
无水乙酸钠 5g MgSO4.7H2O 0.58g MnSO4.1H2O 0.25g
K2HPO4.3H2O 2g 吐温-80 1ml pH=7.0±0.1 115℃ 灭菌30min。
1.2.2 胰月示（胰胨）-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础 （TSC）培养基：购自青岛海博生物技术有限公司，按照厂家说明书配制即可，115℃ 灭菌30min。
1.2.3 强化梭菌（RCM）培养基：购自青岛海博生物技术有限公司，液体按照厂家说明书配制即可，固体配制时添加1.2%琼脂粉于培养基中，115℃ 灭菌30min。
1.2.4 致病菌生长培养基（g/L）：
葡萄糖 10g 蛋白胨 5g 酵母粉 5g NaCl 5g pH=7.0±0.1，固体培养基加琼脂粉1.6%，115℃ 灭菌30min。
1.3 实验方法
1.3.1 嗜酸乳杆菌培养过程
取甘油管1支，用接种环划线至MRS（1.2.1）固体板上37℃培养48h长出单菌落，接单菌落于MRS 50ml液体培养基中，37℃ 130rpm培养20h，取6ml菌悬液接种于MRS 300ml液体培养基中，37℃ 130rpm培养20h。
1.3.2 大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌培养过程
取甘油管1支，吸取100ul菌悬液接入100ml致病菌生长培养基（1.2.4）中，八层纱布扎口，37℃ 200rpm 培养约16h。
1.3.3 产气荚膜梭菌培养过程
取甘油管1支，划线至TSC（1.2.2）板上，放入厌氧袋中厌氧培养，37℃厌氧培养约16h长出单菌落。将一个单菌落接入100ml RCM（1.2.3）液体培养基中，将三角瓶放入厌氧袋中，37℃厌氧培养约16h。
1.3.4 嗜酸乳杆菌发酵上清液分离及高温处理过程
取嗜酸乳杆菌MRS发酵液加入50ml灭菌的离心管中，12000rpm 离心5min，收集离心上清液。将离心上清液10ml分别装入3支无菌的试管中，放入80℃、90℃、100℃水浴处理10min后迅速冷却备用。
1.3.5 对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌抑菌实验过程
将培养好的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌菌悬液100ul加入到致病菌生长培养基（1.2.4）板上，立即用涂布器涂布均匀，用灭菌的1ml蓝色枪头砸孔，加入嗜酸乳杆菌未经处理离心上清液和不同水浴温度处理的嗜酸乳杆菌离心上清液300ul于孔中，静置放置约1.5h后于37℃ 培养箱培养20h后观察抑菌圈大小。
1.3.6 将厌氧培养好的产气荚膜梭菌菌悬液
将培养好的产气荚膜梭菌菌悬液100ul加入到RCM（1.2.3）板上，立即用涂布器涂布均匀，用灭菌的1ml蓝色枪头砸孔，加入嗜酸乳杆菌未经处理离心上清液和不同水浴温度处理的嗜酸乳杆菌离心上清液300ul于孔中，静置放置约1.5h后装入厌氧袋中，37℃ 厌氧正向放置培养20h后观察抑菌圈大小。
2 实验结果
2.1 嗜酸乳杆菌发酵离心液对致病菌抑菌效果
嗜酸乳杆菌发酵离心液对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌抑菌效果见表2。
表2 嗜酸乳杆菌发酵离心液对致病菌的抑菌效果
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样品名称 |
对致病菌抑菌圈（cm） |
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大肠杆菌 |
沙门氏菌 |
金黄色葡萄球菌 |
产气荚膜梭菌 |
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嗜酸乳杆菌离心液 |
2.3cm |
2.5cm |
2.4cm |
2.5cm |
2.2 高温处理嗜酸乳杆菌发酵离心液对致病菌抑菌的影响
将嗜酸乳杆菌发酵离心液经80℃、90℃、100℃水浴处理10min后，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌抑菌效果见表3。
表3 不同温度处理嗜酸乳杆菌发酵离心液对致病菌抑菌的影响
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样品名称 |
对致病菌抑菌圈（cm） |
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大肠杆菌 |
沙门氏菌 |
金黄色葡萄球菌 |
产气荚膜梭菌 |
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离心液80℃水浴处理10min |
2.2cm |
2.5cm |
2.2cm |
2.6cm |
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离心液90℃水浴处理10min |
2.2cm |
2.5cm |
2.2cm |
2.4cm |
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离心液100℃水浴处理10min |
2.2cm |
2.4cm |
2.1cm |
2.4cm |
3 结论
本文利用一株分离得到的嗜酸乳杆菌HEW-A912进行发酵培养，研究发现其产酸能力强，在MRS培养基发酵培养20h，其最低pH值可以将至3.60，检测发酵液中的总酸含量（以乳酸计）在1.65g/100ml。同时为验证代谢产物的抑菌效果将发酵液12000rpm离心5min，取上清液进行抑菌实验，发现对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌均有很好的抑菌效果，将发酵液上清经过80℃、90℃、100℃水浴处理10min后，其对以上四种致病菌的抑菌效果未发现明显变化，依然显示出很好的抑菌效果，说明其代谢产物中的抑菌活性物质耐热稳定好。
参考文献
[1] 赵瑞香, 李元瑞, 郭洋. 嗜酸乳杆菌抑菌特性的研究[J]. 中国微生态学杂志, 2001, 13(006):318-319.
[2] McDonough F E, Wong N P, Hitchins A, et al.1987. Alleviation of lactose mal-absorption from sweet acidophilus milk[J]. Amer. J. Clin. Nutr. 42:345-346
[3] 许启泰，张瑜，杜钢军，陈柏全，包翠屏等.2004.嗜酸乳杆菌胞外多糖对小鼠免疫功能的影响[J].中国药理学通报.12:1401-1403
[4] 张英春，张兰威，王玉军等.2004.分纯益生菌共生及功能特性研究[J].研究与探讨.8:59-62
