通过紫外诱变提高屎肠球菌生产性能的研究

摘  要：饲用屎肠球菌在动物养殖中具有很重要的作用，为了提升其发酵生产性能，以屎肠球菌HEW-A501为出发菌株，通过紫外诱变选育出生长良好、活性较高、性状稳定且具有工业生产价值的屎肠球菌菌株HEW-A501Z8、HEW-A501Z21、HEW-A501Z27，与出发菌株HEW-A501相比，其生长速率、活性均有显著性提高。

关键词：紫外诱变，屎肠球菌，发酵生产

菌种是发酵企业核心竞争力，菌种决定一个发酵产品的有无，菌种在发酵生产企业中有着非常重要的作用。生产菌种的性能是生产优质发酵产品的关键指标，发酵性能通常从活性、产酸能力、抑菌性能等方面来进行评价。屎肠球菌作为消化道内的优势菌群，具有较强的耐受性和定植能力[1]，是一种兼性厌氧化能异养乳酸菌，适合于生产和应用。屎肠球菌能够促进动物营养物质的吸收，并能够有效抑制肠道中致病菌和腐败菌的繁殖，从而达到预防肠道感染和防止腹泻的效果，还能提高动物的免疫力[2]。因此筛选发酵性能良好的屎肠球菌菌种，已成为新型微生态制剂的菌种的热点。

诱变育种是通过物理或化学诱变剂处理均匀分散的细胞群，提高其突变率，从中筛选出符合育种目的的菌株，为生产或科学研究用[3]。在物理诱变剂中紫外线使用最广[4]，因此本研究采用紫外诱变对屎肠球菌HEW-A501进行诱变，筛选出高活性菌株，为新型微生态制剂提供优良菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

屎肠球菌HEW-A501，由好实沃生物研发中心筛选鉴定获得。

1.1.2 培养基

培养基Ⅰ：蔗糖2.5%，大豆蛋白胨1.8%，酵母膏0.4%，氯化镁0.171%，硫酸锰0.045%，氯化钠0.2%，碳酸钙0.0625%，pH7.0±0.2。

培养基Ⅱ：胰蛋白胨2%，酵母膏0.5％，氯化钠0.5%，柠檬酸三钠0.1%，柠檬酸铁铵0.05％，pH7.0±0.2。

培养基Ⅲ：蛋白胨2 %，酵母浸膏0. 5%，葡萄糖0.2 %，磷酸氢二钠%，磷酸氢二钾0.4%，pH7.0±0.2。

MRS培养基：蛋白胨1%，葡萄糖2%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，乙酸钠0.5%，磷酸氢二钾0.2%，柠檬酸氢二氨0.2%，硫酸镁0.058%，硫酸锰0.025%，吐温80 0.1%，pH 7.0±0.2。

1.2 主要仪器和设备

CBIO-UV4型紫外诱变仪（北京赛百奥科技有限公司），L5型紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司），水平流HS型HS-840/1300超净工作台（苏州尚田洁净技术有限公司），ME104E型分析天平（上海微川精密仪器有限公司），YAMATO 高压蒸汽灭菌器SQ510C（上海人和科学仪器有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 屎肠球菌HEW-A501生长曲线测定

将菌种HEW-A501按1%（V:V）的接种量接种于培养基Ⅰ，37℃，180r/m震荡培养24h，每2h取样，用分光光度计检测HEW-A501发酵液的OD值，以未接种的培养基Ⅰ作为空白对照，以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制屎肠球菌HEW-A501的生长曲线[5]。

1.3.2 紫外诱变的菌悬液制备

取活化后的HEW-A501菌液转接至MRS液体培养基中，37℃，震荡培养至对数生长期中期，用移液管取出菌液10mL，3000r/min离心15-20min，去上清液，收集菌体，用10mL的生理盐水多次洗涤，洗净残留的培养基，然后将细胞重新悬浮在生理盐水中，调节细胞浓度为107cfu/mL，制成HEW-A501细胞悬浮液。

1.3.3 紫外诱变屎肠球菌HEW-A501

取菌悬液0.1mL于MRS平板上，涂布均匀，根据经验放到距离功率为30W的紫外灯管30cm处，为了稳定光波可，照射前应先开启紫外灯预热20min，然后打开培养皿盖，开启紫外灯进行诱变照射，照射时间分别为0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、80、100、120s，关闭紫外灯，盖上培养皿盖，用黑布包好平板，于37℃暗培养2～3d，培养后统计生长菌落数，以未经诱变的平板作为对照，计算存活率、致死率[6]。

致死率（%）=（对照组的菌数-诱变后的菌数）/对照组的菌数×100%

1.3.4 屎肠球菌高活性菌株的筛选

从致死率80%的突变菌株平板上挑取菌落较大、生长快的菌落，将原始菌株及筛选获得的25株诱变后菌株分别接种于液体培养基Ⅰ中，37℃，180r/m震荡培养12h后，检测发酵液中的活菌数，发酵液中活菌数最高的菌株即为高活性突变株。为了验证变异菌株高活性，利用不同的发酵培养基（MRS培养基、培养基Ⅱ和培养基Ⅲ）进行，检测发酵液中活菌数，

1.3.5 发酵液活菌检测

发酵液活菌检测采用菌落计数法，取培养后发酵液0.5mL于4.5mL灭菌生理盐水中，混匀，此为10-1菌悬液，一次进行梯度稀释至10-7、10-8，分别取稀释至10-7、10-8的发酵液1mL于灭菌培养皿中，每个稀释度做三个平行，然后加入冷去至45℃左右的MRS培养基，轻轻摇匀，待冷却后置于37℃恒温培养24-48h，计数。

1.3.6 高活性突变株的遗传稳定性试验

将获得的高活性突变株，连续传代5代以上，接种于发酵培养基Ⅰ中，分别检测其活性。

2 结果与分析

2.1 HEW-A501的生长曲线

用于诱变处理的菌种一般处于对数生长期，对数生长期的菌体生长比较同步，且容易变异、重复性好，这样也保证了处理时菌体具有一定的细胞浓度，还能增加可能变异的细胞数, 因此常选用对数生长中后期的菌体细胞供诱变处理。选用对数生长中后期10h的菌液作为菌悬液，用于诱变处理（图1）。

图1 屎肠球菌HEW-A501的生长曲线

2.2 紫外诱变时间对HEW-A501致死率的影响

紫外诱变处理微生物，微生物吸收射线的剂量一般取决于紫外灯的功率、照射距离及照射时间。本试验根据经验采用30W紫外灯，照射距离为30cm，一般微生物的营养体3-5min即可致死，而革兰氏阳性菌只需0.5-2.0min就可死亡[5]。不同照射时间的紫外诱变致死率如图2所示。

紫外诱变时间一般选择致死率为90%~99%的照射剂量，有研究表明[7~8]致死率为99%时，可使菌体发生最大程度的突变，但有研究表明一般紫外诱变的正突变主要出现在低剂量诱变中，所以目前致死剂量一般选择80%~90%的照射剂量，甚至更低即70 %~80 %的致死率剂量[9]。综合考虑，本实验中选择在30W紫外灯，菌悬液距紫外灯管30cm下，紫外诱变剂量为50s。

图2 屎肠球菌HEW-A501不同照射时间的紫外诱变致死率

2.3 紫外诱变结果

通过30W紫外照射50s对屎肠球菌HEW-A501进行诱变，从初筛平板上挑取菌落较大的菌落进行分离纯化，37℃恒温培养, 复筛时选择生长较快的菌株，测定发酵液的pH，结果如表1所示。综合考虑菌株的生长时间和pH，选择HEW-A501Z8、HEW-A501Z21、HEW-A501Z27作为高活性诱变菌株。

表1 屎肠球菌HEW-A501诱变结果

菌株	长出时间（h）	pH	活菌数（亿cfu/mL）
HEW-A501	20	4.68	15.2
HEW-A501Z1	20	4.51	15.4
HEW-A501Z2	21	4.62	15.7
HEW-A501Z3	19	4.55	16.8
HEW-A501Z4	18	4.43	17.5
HEW-A501Z5	23	4.68	14.3
HEW-A501Z6	20	4.57	15.6
HEW-A501Z7	17	4.55	12.3
HEW-A501Z8	10	4.15	22.4
HEW-A501Z9	16	4.43	19.7
HEW-A501Z10	17	4.52	18.6
HEW-A501Z11	15	4.39	20.1
HEW-A501Z12	15	4.35	24.8
HEW-A501Z13	22	4.67	13.4
HEW-A501Z14	20	4.55	16.3
HEW-A501Z15	21	4.54	15.4
HEW-A501Z16	18	4.39	20.4
HEW-A501Z17	19	4.47	19.6
HEW-A501Z18	18	4.31	20.5
HEW-A501Z19	17	4.38	19.5
HEW-A501Z20	19	4.54	17.8
HEW-A501Z21	13	4.18	24.8
HEW-A501Z22	16	4.29	20.7
HEW-A501Z23	18	4.37	18.8
HEW-A501Z24	20	4.58	16.4
HEW-A501Z25	21	4.66	16.0
HEW-A501Z26	17	4.53	11.3
HEW-A501Z27	12	4.11	26.5
HEW-A501Z28	18	4.63	8.9
HEW-A501Z29	21	4.21	15.6
HEW-A501Z30	18	4.38	16.3

高活性诱变菌株HEW-A501Z8、HEW-A501Z21、HEW-A501Z28在三种不同的发酵培养基的活菌如表2所示，可知诱变菌株活性均显著高于出发菌株HEW-A501。

表2 不同培养基中高活性诱变菌株的活性

菌株	MRS培养基 活菌数（亿cfu/mL）	培养基Ⅱ 活菌数（亿cfu/mL）	培养基Ⅲ 活菌数（亿cfu/mL）
HEW-A501	16.0	15.8	15.4
HEW-A501Z8	22.5	22.5	22.7
HEW-A501Z21	24.5	24.7	24.9
HEW-A501Z27	26.0	25.8	26.4

2.4 高活性菌株的遗传稳定性

将获得的高活性突变株HEW-A501Z8、HEW-A501Z21、HEW-A501Z27，以HEW-A501作为对照组，分别连续传代5代以上。由表3可见，诱变后菌株HEW-A501Z8、HEW-A501Z21、HEW-A501Z27与原始菌株HEW-A501相比，高活性诱变菌株遗传稳定性良好且活性高，可以作为下一步研究的新菌种。

表3 高活性菌株的遗传稳定性结果

3结论与讨论

发酵生产的关键是菌种，首先必须具备良好的菌种基础，才能进行发酵工艺改进进而获得理想的发酵产品。诱变育种是工业生产中获得优良菌种的重要途径。本研究采用的是紫外诱变，通过30W紫外灯，照射时间50s，照射距离为30cm，筛选出高活性菌株HEW-A501Z8、HEW-A501Z21、HEW-A501Z27，与出发菌株HEW-A501相比，其活性有显著提高，且产酸也有一定程度提高、稳定性好。在37℃培养时，诱变菌株HEW-A501Z8、HEW-A501Z21、HEW-A501Z27

和出发菌株HEW-A501的生长速率差异不大，但稍高于出发菌株。说明变异菌株的遗传物质发生了改变，但突变机制尚不清楚，有待于进一步进行分子水平上的研究。

参考文献

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